酵母富硒工艺优化研讨分析
摘要：本文通过正交试验，对酵母富硒工艺进行了优化。结果表明：酿酒酵母具有较强的富硒能力。在适宜的条件下，以YEPD为培养基、加硒量16mg/L、8%的接种量、28℃培养30h，有机硒含量可达12.39mg/L、转化率为82.62%.
关键词：酿酒酵母；富硒；优化研究
硒是人体生命中不可缺少的微量元素之一，在人体内总含量为14~20毫克，广泛分部于所有组织器官中，浓度高者有肝、胰、心、脾、牙及指甲，而脂肪组织中浓度最低，它对人体的正常代谢起着重要的调节作用，因而被喻为“生命火种”、“抗癌之星”。
同时硒是一种稀散元素，不同地区食物中的硒含量不同，这与地理环境中的硒含量有关，在世界27个国家及美国几十个洲的流行病理学调查研究结果表明：土壤、食品、水中的含硒水平越低，癌症及心脑血管疾病的发病率及死亡率越高。硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的成份，参于辅酶A和辅酶Q的合成，是良好的营养调节剂、抗氧化剂、对抗金属的解毒剂，缺“硒”将会导致40多种疾病的发病率增高。然而自然界的“硒”在地壳中的含量极低，且与其它元素共生，人体难以吸收，全世界共有40多个国家缺硒，我国缺硒省份高达22个。
目前国内外盛行用无机硒作为补硒制品，如亚硒酸钠片剂。但是无机硒与有机硒相比，有生物活性低而毒副作用大，且不易吸收等问题。针对我国缺硒现象是普遍存在的这一现状，如能通过每天摄入一定量的富硒食品即能达到理想的补硒效果，从而实现强身健体、延长寿命的作用己成为目前功能性食品研究的迫切课题之一。在研究众多的富硒制剂和食品添加剂中，酵母经富硒培养后得到的富硒酵母，因其自溶物中有机硒含量高，同时还含有丰富的氨基酸、核苷酸、多肽、蛋白质和一些微量元素与维生素，可作为良好的富硒食品的添加剂而倍受重视。而如何获得含硒量高的酵母是一个重要的前提，本文研究了酿酒酵母1605富硒工艺的优化。
１ 材料与方法
1.1 材料
1.1.2 培养基
（1）YEPD培养基 葡萄糖２％，蛋白胨２％，酵母膏１％，自然PH值，固体加２%琼脂、
（2）麦芽汁培养基 自制麦芽汁10º
（3）加入的硒均单独灭菌。
1.1.3 试剂
0.2mol/L EDTA-2Na；5% NaOH；0.5% ３、３′-二氨基联苯胺；甲苯；1:1HCl；1μg/ml 硒标准溶液等。
722S分光光度计；LRH－150B 生化培养箱；SW-CJ
1.2 方法
菌种活化→驯化
↓
培养基配制→发酵培养→发酵液分离→清洗→新鲜硒酵母→干燥(100℃，5h)→富硒酵母 ↓
取上清液→硒含量测定→计算酵母硒含量及有机硒转化率
将少量固体原种接入YEPD液体培养基中，在
首先通过预备试验确定因素和水平，然后通过正交试验确定其最优化工艺条件。
将待分离发酵液用高速离心机4000rpm离心20分钟，分成两部分，上清液取出备后续测定使用，下层酵母沉淀用无菌水清洗两遍，得新鲜湿酵母。将湿酵母置
在PH２~３条件下，硒与3、3′－二氨基联苯胺（DAB）反应形成稳定的Se-DAB络合物，显色反应在30分钟内完成。在PH6左右时，通过甲苯萃取，在该体系中络合物最大吸收波长为420nm。可通过分光光度计测定其吸光度，先绘制出标准硒曲线，然后再测出样品吸光度，可从该标准曲线上查出对应的硒含量。
准确称取
准确吸取1μg／ml硒标准液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，分别移入分液漏斗中，加水至35ml。分别加入5％EDTA-2Na溶液1ml，摇匀，用1:1盐酸调节pH2-3左右，各加0.5％3，3′-氨基联苯胺溶液4ml，摇匀，置于暗处30分钟，再用5％氢氧化钠溶液调节至中性，加10ml甲苯振摇2分钟，静置分层，弃去水层，甲苯层通过棉花栓过滤于比色皿中，于420nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线(见图1)。
.jpg)
取适量样品，5000rpm高速离心机离心30min，取20ml上清夜，加水至35ml，加入5％EDTA-2Na溶液 1ml，以下同标准曲线。根据样品测得的吸光度，从标准曲线中查得相应的硒含量，此为无机硒含量。
有机硒含量=总硒含量一残留无机硒含量
２ 结果与分析
2.1 正交因素水平确定
发酵培养时间直接影响酵母生长的几个不同阶段，酵母中的硒含量取决于酵母生长过程中吸收、转化无机硒的量。10%试管种子分别接种到含亚硒酸钠9mg/L、12 mg/L、15 mg/L培养基中，28℃培养，每隔一定时间测定酵母的数量，获得酵母生长曲线（如图2）。
从图2可以看出，培养至25~35h时酵母生长达到稳定期，酵母产量基本接近最高值。因此在后面的正交试验中选取了发酵培养时间为25h、30h、35h三个水平。
酵母对于硒的转化，在一定的浓度下可以将无机硒转化为有机硒。在高浓度硒存在的环境下，酵母虽然仍可以生长，但体内硒过量而转化为单质硒沉积在细胞内，使酵母出现微红色，甚至红色。因此由实验得到在硒浓度为20 mg/L条件下，酵母呈现出微红色，此值可认为是一个临界点，即菌体内无机硒开始积累的标志，因此在正交试验中选取了发酵培养基中硒浓度12 mg/L、16 mg/L、20 mg/L三个水平。
在一般的发酵培养中接种量多为10%左右，此处为了研究初始菌量对硒产量的影响，选取了8%、10%、12%三个水平。
而对于不同的培养基条件，在实验中发现其酵母生长量基本一致，即在麦芽汁中和YEPD培养基中的酵母生长情况是一致的，二者没有太大的区别。故在后续实验中选取了YEPD培养基作为实验用培养基。
2.2 富硒工艺优化
酵母富硒工艺的优化，是以酵母中的硒含量及有机硒转化率的高低来衡量的，通过以上分析，影响酵母中硒含量及有机硒转化率的主要因素有以下３个，富硒正交试验各因素水平见表1
表1 富硒正交试验因素水平表
因 素 | 水 平 |
1 2 3 | |
A（Se含量mg/L） 12 16 20 B（培养时间/h） 25 30 35 C（接种量/%） 8 10 12 | |
通过正交试验确定酵母发酵培养的最优工艺条件，以上面所取的三个因素，三个水平进行正交试验。试验结果见表2。
表2 富硒正交试验结果