论山楂叶粗品多糖的分级纯化及纯度测定

摘要：将山楂叶中的水溶性多糖成分提取出来，然后通过Sevage法来除去其中的蛋白质，用透析法来除去低分子量物质，再通过离子交换柱和凝胶柱洗脱来进行进一步的分离纯化。通过电泳、凝胶柱层析和高效液相凝胶色谱法来测定多糖精品的纯度，证明其纯度很高。

关键词：山楂叶  粗品多糖　 纯化  纯度  测定

一、对山楂叶粗品多糖的分级纯化

（一）材料与方法

  　　在这里，我们是用过离子交换柱和凝胶柱来达到纯化多糖样品的目的。采用的离子交换柱为CM-纤维素柱，凝胶柱则为SephadexG-100。我们采用的是先过离子柱洗脱再过凝胶柱洗脱。

1.    材  料

1.1  仪　器

  　 玻璃柱(规格为Ф2×30cm), 玻璃柱(规格为Ф2×100cm ），LC-10AT SHIMADZU 液相泵2台(一作主泵A,一作副泵B)，BSZ-100自动分布收集仪，收集管, 756MC紫外分光计

1.2  试  剂

　　5mM 的N_aA_C溶液（PH=4.5,0.4g/L），1N 的N_aCL（溶于5mM 的N_aA_C溶液中），0.1NNaCL溶液，水为经过脱气过滤处理的去离子水。0.1g蒽酮与50ml浓硫酸混合成的蒽酮－硫酸液，均为分析纯。

1.3  其它材料

CM－纤维素填料

SephadexG-100凝胶填料

两者均为进口。

2.   实验方法

2.1　过CM－纤维素离子交换柱

　　先将CM－纤维素填料装入玻璃柱（规格为Ф2×23cm ）中，以5mM 的N_aA_C洗脱液将两个液相泵(A泵和B泵)与柱联接成一真空系统，以0.5ml/min的流速平衡一天，之后即可上样，采用梯度洗脱，母液为5mM 的N_aA_C溶液，梯度液为1N 的N_aCL溶液（从0.2N～0.8N），上样量为5ml（浓度０.1g/ml），流速0.5ml/min，隔15min收集一管，从第20管开始进行梯度洗脱。每隔两管用蒽酮－硫酸法监测[以管号为横坐标，620nm处紫外吸收值（OD值）为纵坐标作图]，分别按相关峰位收集并冻干。之后取主要产物过SephadexG-100柱进行进一步的分离。

2.2      过SephadexG-100凝胶柱

将SephadexG-100凝胶填料装柱（规格为Ф2×85cm），再通过0.1NNaCL洗脱液把A泵与柱连接起来，以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上样，上样量为5ml（浓度０.1g/ml），用0.1NNaCL缓冲溶液以0.3ml/min流速洗脱，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法监测，分别按相关峰位收集并冻干。

            （二）结果与分析

1. 过CM－纤维素离子交换柱结果

山楂叶粗品多糖KS经过CM－纤维素柱梯度洗脱，分别按相关峰位收集并冻干之后，得到四个组分：KS₁、KS₂、KS₃、KS₄（如图2）。其中，KS₁占14%，KS₂占25%，KS₃占52%，KS₄占9%，均为白色絮状物。这里，KS₃是主要组分。

2.  过SephadexG－100凝胶柱洗脱结果

当KS₃经过SephadexG-100柱洗脱，按相关峰位收集并冻干之后，可分成两个组分KS₃′、 KS₃″（如图3）。KS₃′占28%，KS₃″占72%。这里，根据含量比例大小的比较，KS₃″为主要产物。 

图 2  山楂叶多糖粗品（KS）过CM-纤维素柱洗脱曲线

Fig 2  Elution patterns of Crataegus pinnatifida leaves’ crude polysaccharide （KS）extract on CM-cellulose column 

图 3  山楂叶多糖（KS₃）过SephadexG-100凝胶柱洗脱曲线

Fig 3  Elution patterns of Crataegus pinnatifida leaves’ crude polysaccharide （KS₃）extract on SephadexG-100 column

二、纯度测定

    这里，纯度的测定方法我们是采用了醋酸纤维薄膜电泳法、SephadexG-200凝胶过柱法和高效液相凝胶色谱法（HPGPC）；分子量的测定则是采用了高效液相凝胶色谱法（HPGPC）。

（一）材料与方法

1.　仪　器

DYY—Ⅲ型水平电泳槽（北京六一仪器厂产）、美国产BIO-RAD电泳仪、冰箱，Waters 液相色谱仪、RID-6A示差检测器，柱为MACROSEPHERE GPC （250mm×4.6mm），LC-10AT SHIMADZU 液相泵、756MC紫外分光计，Waters510液相泵，5ul微量进样器。

2.　试　剂

2.1      测纯度所需试剂

2.1.1          醋酸纤维素薄膜电泳所需试剂

    　　硼酸盐溶液：0.2N硼酸溶液及KCL溶液各125ML，0.2N氢氧

                 化钠溶液219.5ML混合后加水稀释至1L。

氧　化　液：1.2g高碘酸溶于30ml水中，加入15ml0.2N醋酸

　　　　　　钠溶液及100ml乙醇，置暗处，可使用数日。

还　原　液：5g KI+5g Na₂SO₃溶于100ml水，加入150ml乙醇

　　　　　　及2.5ml2N HCL，随加随搅动，现用现配。

染　色　液：2g碱性品红溶于400ml沸水中，冷至50℃过滤，

　　　　　　通入二氧化硫气体至褪色，密封后置暗冷处保存，

　　　　　　如溶液变红，则不能使用。

　　　　冲　洗　液：1ml浓盐酸加0.4g偏重亚硫酸钾溶于100ml水中。

2.1.2                               HPGPC和过SephadexG-200柱所需试剂

     去离子水（经过脱气过滤处理），0.1N NaCL溶液。

2.2  测分子量所需试剂

 去离子水（经过脱气过滤处理）,已知分子量的葡聚糖系列BluG（蓝色葡聚糖）、Wt66,900、Wt37,500、Wt20,000、Wt9,900、Glc(葡萄糖)、样品。这里，Wt后的数字为该标品的分子量。另外，所有标品和样品均用去离子水配成0.2%浓度。标品为德国进口纯。

3.  其它材料

  SephadexG-200凝胶填料——进口

　醋酸纤维素薄膜——国产

4. 检测多糖纯度

4.1 醋酸纤维素薄膜电泳

　　取8×12cm长度的醋酸纤维薄膜，在PH10.0硼酸盐溶液中浸透后，将其夹于两张干净滤纸中间吸干，再于无光泽面点样，然后将其架于电泳槽上，尽量平直，然后用微量注射器吸取2~4μL的1%的样品溶液（溶于缓冲液中），在薄膜的无光泽面上距一端2cm处呈线状点样，注意使点样线宽度不超过1mm且两端距薄膜边缘不少于4mm。点样面向下，以滤纸搭桥，取电压220V，在0℃下电泳20min ，然后取出膜条置95%乙醇溶液中固定，再置于氧化液中氧化6min，取出用70%乙醇浸洗，之后再浸入还原液中还原8min，取出用70%乙醇浸洗，然后浸入染色液中染色，至色带出现为止，再用冲洗液冲洗，则有糖区显紫红色，无糖区无色。这里，共做三个样品的电泳图谱：混合标样（Wt 9,900、Wt 66,000、Wt37,500、 Wt20,000，比例相同）、单一标样Wt 20,000的标样、KS₃″。

4.2 高效液相凝胶色谱法（HPGPC）

将样品用缓冲液配成0.2%浓度，每次进样量为20ul，流速为 0.3ml/min，温度25～30℃。

4.3 过SephadexG-200柱

　　将SephadexG-200凝胶填料装柱（规格为Ф2×85cm），再通过0.1NNaCL洗脱液把A泵与柱连接起来以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上样，上样量为5ml（浓度0.1g/ml），用0.1NNaCL缓冲溶液以0.3ml/min流速洗脱，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法监测，分别按相关峰位收集并冻干。

5. 测定分子量

这里，采用高效液相凝胶色谱法（HPGPC）测定多糖精品的分子量。基本操作条件与前面的4.2HPGPC纯度测定相同，不同的是这里是依次将各个标准样品多糖洗脱，记下出峰时间t_R。再将多糖样品液洗脱，记下出峰时间，然后根据公式算出对应样品的分子量。

（二）结果与讨论

1. 纯度鉴定方面

1.1  醋酸纤维素薄膜电泳

实验结果显示，电泳方向为由正极向负极移动。KS₃″电泳图谱为单一色带，单一标品亦为单一色带，而标品混合样为一色斑（如图4）。

1.2  过高效液相色谱检测

　　KS₃″经过HPGPC检测为单一组分（如图5）

1.3　结　论

　　经过两种方法的检测后，我们可以认定，山楂叶多糖精品KS₃″为高纯度多糖精品。　　

 A            B           C

图 4  山楂叶多糖纯品（KS₃″）的醋酸纤维素薄膜电泳图谱

Fig 4  Patterns of Crataegus Pinnatifida leaves pure extract KS₃″ by cellulose acetate fiber electrophoresis

          A：混合标品（Wt66,000、Wt37,500、Wt20,000、Wt9,900）

          B：山楂叶多糖纯品（KS₃″）

          C：Wt20,000

图 5   山楂叶多糖纯品（KS₃″）的HPGPC检测图

Fig 5  Determination of Crataegus Pinnatifida leaves pure extract  KS₃″by HPGPC