烟草根结线虫卵寄生真菌的筛选（图）

摘　要　本研究对采自云南省各地州烟草根结线虫发生地域的土壤、病根样品进行根结线虫卵寄生真菌的筛选、测定，从中筛选到了5株对南方根结线虫卵寄生效果显著的菌株，其寄生率达69.5-95.5%。田间小区试验表明，生防菌剂在烤烟团棵期前对南方根结线虫数量防效可达35.49-84.29%，其中生防菌FDT-10、HLD-5-8的防治效果与化学药剂相当。

　　关键词　烟草根结线虫　卵寄生真菌　南方根结线虫　寄生率

　　根结线虫（Meloidogyne　spp.）是危害农作物的重要病原之一，其在全世界广泛分布，寄主范围广泛，植物受害严重，世界上重要的经济作物每年由根结线虫病造成的损失高达数百亿美元[1]。同时它能使真菌和细菌易于侵染植物，是诱发植物病害的重要原因之一[2]。

　　对于根结线虫的防治，自40年代发现化学杀线剂后，其在线虫防治中大显身手。但化学杀线剂的高成本、高毒性及高残留，对环境污染严重，使用过程中对人、畜也不安全，因此许多化学杀线剂已被禁用；轮作和抗性品种等的应用对根结线虫的防治有一定的作用，但有其局限性。因此人们在开发一些高效、低毒、低残留、高选择性的杀线剂的同时，生物防治线虫病害日益受到重视。

　　根结线虫在土壤中受许多生物影响，尤其是线虫寄生真菌被认为是自然条件下控制线虫的主要因子之一。近年来，我国学者对根结线虫的致病性、分布、病原特征、发生规律和防治等做了大量的研究1。国外学者曾有报道粉红粘帚霉菌（Gliocladium　roseum）和哈次木霉（Trichoderma　harzianum）及绿色木霉（Trichoderma　viride）对线虫具有生防活性[3-5]，且世界上许多国家利用淡紫拟青霉防治根结线虫孢囊等多种线虫获得成功[6]。目前已报道的根结线虫寄生真菌30多种，研究最多的是Paecilomyces　lilacinus和Verticillium　chlamydosporium。寄生真菌对根结线虫的寄生率或致病力测定是生物防治的基础工作。但目前国内仅少数人对根结线虫的寄生率或致病力作过测定（马承铸等，1991；张克勤等，1991；Rodriguez　KRet　al.，1998）[7,8]。Godoy　GR等（1982）研究14种真菌对胞囊线虫（Heterodera　glycines）和花生根结线虫（Meloidogyne　are　naria）的寄生性。本课题组从1998年开始，从云南省各地植烟区采集分离了大量的根结线虫生防菌株，进行了烟草根结线虫生物防治途径的探索研究。本文主要报道室内根结线虫卵寄生真菌的筛选结果及部分菌株的田间小区试验结果。

　　1材料与方法

　　1.1分离出根结线虫二龄幼虫，挑取活动缓慢或死亡幼虫经灭菌水漂洗后，于PDA培养基上培养，培养一周后观察生长的菌落，分离进行纯培养。

　　1.2从病根样品中挑取根结线虫雌虫，选取褐色雌虫用0.1%NaClO进行表面消毒，灭菌水反复冲洗，于2%水琼脂平板上25℃培养，培养一周后观察生长的菌落，分离进行纯培养。

　　1.3将从样品中分离到的线虫卵分散在2%水琼脂平板上，24-48小时后观察，将有真菌定殖现象的卵转移到PDA营养培养基上，25℃暗培养，待真菌长出，鉴定保存。

　　1.4平板分离：分离采用drechsler法（张克勤等，1991）。

　　1.5菌株有效性测定：

　　1.5.1将菌株于PDA平板上涂布培养6天，待菌株充分生长产孢后用灭菌水冲洗制备成相同数量级的孢子液备用。

　　1.5.2于温室盆栽番茄根系挑取发育基本一致的根结线虫卵块，于100筛目的筛子上用流水缓缓冲洗，后置于500ml三角瓶内加1.5%NaClO200ml剧烈震荡3-4min，将卵块充分震荡分离，自来水充分冲洗，用200、500目筛进行收集，于500目筛上即可收集到纯净的卵，无菌水多次冲洗，稀释计数备用。

　　1.5.3充分摇匀孢子液和线虫卵液，吸取2ml孢子液和0.5ml线虫卵液于一灭菌试管中，以2ml灭菌水加0.5ml线虫卵液为空白对照，每处理六次重复，于6天后观察线虫卵孵化情况以及用Axiovert135倒置显微镜镜检各处理菌株对线虫卵的寄生情况。

　　1.5.4将各处理被寄生的线虫卵挑出，用灭菌水在500筛目筛网上充分冲洗收集，接种于PDA培养基上进行再分离，比较再分离获得的菌株与接种菌株是否为同一菌株。

　　1.6优良菌株的田间小区试验：

　　1.6.1试验安排：试验地选择根结线虫常年发生较重的植烟地（田）块。处理为A（HDZ-9-2）、B（YMD）、C（FDT-10）、D（HLD-5-8）、E（HLD-5-8）、（F）克百威（湖北天门农药有限公司）、（G）空白对照。田间随机区组设计，每处理烟株为30株，三次重复。于烟苗移栽前将药剂塘施。

　　1.6.2试验地土壤根结线虫数量变化调查：烟苗移栽时、烟株团棵期、采收结束分别取土样，漏斗分离法分离调查根结线虫数量变化。

　　2结果与分析

　　2.1室内筛选结果分析

　　通过采用多种实验方法，本研究从云南主要烟区采集的458份样品中初步分离得到菌株432株，主要分属Paecilomyces拟青霉属、Penicillium青霉属、Fusarium镰孢菌属、Mucor毛霉菌属、Phoma柱孢、Verticillium轮枝菌属、Trichoderma木霉菌属、Green　muscardine绿僵菌属。
　　

分离鉴定的各种属真菌比例

　　

表1　室内筛选效果相对较好的菌株

　　通过室内生物测定结果分析表明，所筛选材料中73.0%的菌株对南方根结线虫的卵有寄生作用，寄生率为11.11-95.5%，其中寄生率在50%以上的占28%，寄生率在30-49%的菌株占14%；91.0%的菌株对线虫卵孵化有抑制作用，相对抑制作用达到11.05-87.67%，其中相对抑制率在50%以上的菌株占19%，相对抑制率在30-49%的菌株占26%。综合分析各菌株对线虫卵寄生和卵孵化的影响，初步筛选出效果较好的生防菌株HDZ-9-17、HDZ-9-2、FDT-10、HLD-5-8、YMD-1-17等菌株，供进一步实验。

　　2.2各处理不同调查时期线虫数量变化情况调查结果分析：

　　以下图表表明，供试的各生放菌株在烤烟团棵期以前对根结线虫数量均有较好的控制作用，其中处理D、C、B相对于移栽期土壤线虫数量有明显的减少，相对防治效果达84.29%、83.77%、79.90%，与对照化学药剂处理F防效86.41%相当。但随着时间延长，至烟株菜烤结束时，各处理线虫数量有不同程度的升高，相对防效与团棵期相比明显降低。结合田间小区试验结果和试验点的气候特点分析，认为试验点烤烟移栽后较长时间的干旱以及各生防菌株在土壤中的生活能力的差异，影响了生防菌株在烟株根际的定植和繁殖，从而影响了生防菌的防治效果。本试验结果表明，生防制剂在一定时期内对控制田间根结线虫数量有较好的效果，防治效果与化学药剂相当。通过增强其在土壤中的生活能力及结合药剂施用方法的改进，生防制剂替代化学药剂控制烟草根结线虫为害应用前景广阔。

　　图1　寄生无休止菌对南方根结线虫线虫卵的寄生情况

　　

表　田间试验各处理根结线虫数量变化情况

　　图2　各处理不同调查时期线虫数量变化情况

　　3　讨论

　　3.1有效菌株的筛选过程中较为重要的是要保证使用材料线虫卵的选择一致性，发育一致的线虫卵其孵化时间相对一致，实验统计可靠性较高。

　　3.2该试验的结果表明不同种和种内菌株的寄生率存在明显差异。与林茂松、沈素文等（1994）报道[9]，Tiganomilan（1995）等研究发现不同菌株间致病性（卵寄生）存在很大差异的研究结果[10]相吻合。

　　3.3根结线虫主要以二龄幼虫侵入植株根系继而造成危害。条件适宜的时候二龄幼虫的孵化速度较快，所以筛选的卵寄生真菌必须寄生率高，寄生速度快且能快速在卵内萌发，抑制线虫卵到二龄线虫的孵化。

　　3.4生物防治方法控制烟草线虫病害中，生防菌株在植烟土壤中能否解除与土壤微生物间的拮抗作用，能否保持在自然控制下的土壤生态系统中的稳定平衡性，适应土壤理化性质及生物因子对其的影响而形成优势菌群是其应用的关键。

　　参考文献：
　　[1]　Barker　K　R,Townshend　J　L,Bird　G　W,et　al.　In:Hickey　K　D,ed.　Mothods　for　Evaluating　Pesticides　for　Control　of　Plant　Pathogens.　St.paul,MN:APS　Press,1986.283-296.
　　[2]张绍升.1995.福建省主要作物根结线虫病发生情况调查.福建农业大学学报，24（3）:　307-309.
　　[3]　Dackman　TA,Hertz　B　N.　Fungal　parasites　of　the　cereal　cyst　nematode　Heterodera　avenae　in　Southern　Sweden　[J]　.Journal　of　Nematology,　1985,17　（1）　:50-55
　　[4]　Sailfullah.　Effect　of　nematophagous　fungi　on　the　growth　of　patato　and　Globodera　rostochiensis　and　their　environmental　tolerance　[J].　afroAsian　Tournal　of　Nematology,　1996,6　（2）　:128-132
　　[5]　Khan　TA,Saxena　SK.Ef-fect　of　root　dip　treatement　with　auture　filtrates　of　soil　fungi　on　multipilation　of　meloidogyne　javanica　and　yield　of　tomato　[J]　.Test　of　Agrochemical　and　Cultivars,1997（18）　:50-51
　　[6]　Jatala,P.1986.Biological　control　of　plant-parasitic　nematodes.Ann.　Rev.　Phytopathol.24;453-489
　　[7]马承铸等.北方根结线虫寄生真菌调查.杀虫微生物，1991，3：202～207
　　[8]张克勤等.中国根结线虫生防资源及其利用评价.见中国农学会编：全国首届青年农学学术年会论文集，1991，337～342
　　[9]林茂松，沈素文.厚壁孢子轮枝菌防治南方根结线虫研究初报.生物防治通报，1994，10（1）:　7～10
　　[10]　Tiganomilan　M　S　et　al.Isozyme　characterization　and　Pathogenicity　of　Paecilomyces　fumosoroseus　and　P.　lilacinus　to　Diabrotica　speciosa（Coleoptera,　Chtysomelicdae）and　Meloidogyne　javanica（Mematoda,　tylenchidae）.　Biological　control,　1995,　5:　378-382
　　Screening　of　The　Parasitical　Fungi　of　Eggs　of　Root　Knot　Nematode　in　Tobacco
　　Yang　Shujun　Zhu　Mingliang　Xia　Zhenyuan　Li　Yunhua　Lei　Liping
　　（Institute　of　Yunnan　Tobacco　Science　Yuxi　653100）
　　Abstract:　Soil　and　roots　were　collected　from　fields　where　the　tobacco　nematode　disease　occurred.　The　parasitical　fungi　were　isolated　from　larvae　and　eggs　and　5　of　432　strains　were　effective　in　vitro　by　the　examination　of　parasitical　and　hatching　rates　of　eggs,　the　parasitical　rates　of　the　eggs　of　M.incognita　were　ranged　from　69.5%　to　95.5%.　And　their　biocontrol　efficacy　were　from　35.49　to　84.29%　when　they　were　tested　in　the　trails.　Among　them　starins　FDT-10　and　HLD-5-8　showed　similar　control　efficacy　with　chemical　pestiside.
　　Key　words:　Tobacco　nematode　Parasitical　fungi　of　eggs　M.incognita　Parasitical　rates
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