细菌内毒素简易检测法

王  潇

（天津市津南区八里台镇动物防疫中心站，天津 300350）

摘要：为了快速准确检测出市场出售的肉品是否含有细菌内毒素，快速检出不合格的肉品，文章采用细菌毒素简易检测法—细菌内毒素呈色氧化反应法，对天津市四个市场采集的48份肉样进行了检测。结果表明，检出阳性11份，阳性率为22.9%，该方法省时省力，敏感快速，简便准确，是检验肉品细菌内毒素的一种好方法。

关键词：细菌内毒素；呈色氧化反应法；肉品

中图分类号：     Q939.96              文献标识码：A        文章编号：1674-0432（2010）-08-0068-1

细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构，主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。

1 细菌内毒素的特性

细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。内毒素性质比较稳定，耐热，60℃数小时不被破坏，需在160℃条件下加热2-4h，或用强酸强碱强氧化剂加热3h才灭活。内毒素有多种性质不同的生物学活性：发热反应、白细胞反应（白细胞数目增多）、低血压与休克、弥漫性血管内凝血。

细菌内毒素存在于肉品中，特别是在患病动物、病死动物的肉中大量存在，且不易通过蒸煮等手段将内毒素杀灭。如果人误食了病害肉，摄入的细菌内毒素含量超过一定限量后，会发生热原反应，导致人中毒，出现腹痛、呕吐、下泻、发烧等一系列中毒症状，严重时甚至会昏厥、休克乃至死亡。

2 细菌内毒素检验的常规方法及局限性

内毒素对人危害很大，检验肉品内毒素的方法常用的有以下几种：

通过pH试纸测定肉的pH值，省时快速，但此法仅凭感官判断不准确。

在肉切口中插入滤纸条，观察其被肉汁浸润的情况判定，使用方便快速成本低，但凭感官判别不准确，且不宜检查解冻肉。

测定肉浸液中是否含有过氧化酶来判定。此法较准确，具有诊断意义。但要求操作精度高，难度较大。

鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物与微量细菌内毒素反应，检测出被检物中的内毒素。灵敏度高，重现性好，一次可同时检测几个样品，但试剂昂贵，配试剂危险性高。

硫酸铜肉汤法是利用硫酸铜肉浸液沉淀反应观察是否有絮状沉淀来判定。敏感性较强，但耗时长，麻烦。

3 细菌内毒素检验的新方法

细菌内毒素呈色氧化反应法，是检测细菌内毒素的一种新方法，具有快速敏感，成本低廉的特点，2003年青海省孙建忠兽医师在当地曾用此方法检测了肉品细菌内毒素，但在天津市还没有此类报道。为了调查天津市不同市场肉品受细菌内毒素污染的程度，特进行了本实验——细菌内毒素呈色氧化反应法，检测肉品中细菌内毒素的研究。现报告如下：

3.1 所需材料

3.1.1 肉 在天津侯台、王顶堤、杨柳青、大寺镇市场（不同摊位）各选购牛、羊、猪肉4份肉样，共48份。

3.1.2 试剂 0.5%硝酸银水溶液，1%甲苯酚兰酒精溶液，0.1%苛性钠溶液，40%盐酸水溶液，无菌生理盐水溶液，5%草酸水溶液，1%高锰酸钾。

3.1.3 仪器 试管、溶纸、试管架、滴管、研钵、剪刀、100mL三角瓶、移液管、吸耳球、漏斗、电炉。

3.2 实验原理：

“细菌毒素简易检测法”应用甲苯兰为氧化还原指示剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色。当向含有毒素的被检液中加入硝酸银时，硝酸银能使毒素氧化成氧化型毒素。这种氧化型毒素能与指示剂牢固结合，当向溶液中加入高锰酸钾时，指示剂不被还原，保持其蓝色（阻止指示剂褪色）。当浸出液中没有毒素时，指示剂单独溶于液体中，酸性介质存在时加入高锰酸钾能使指示剂还原为无色，结果溶液中由于剩余的高锰酸钾而呈现红色。

3.3 实验步骤

（1）称取10g除去脂肪和结缔组织的肌肉，放入研钵中剪碎后，向研钵中加入无菌生理盐水10mL、0.1%苛性钠溶液10滴，然后研磨成糊状，再移入100mL三角瓶中，加热煮沸使蛋白质凝固、沉淀。将三角瓶置于水龙头下冷却后再向三角瓶中加入5%草酸水溶液5滴，以进行中和，最后用滤纸将内容物过滤，滤液备用。

（2）取2支试管，1支注入被检浸出液2mL，另1支注入生理盐水2mL，然后按下列顺序向2支试管同时加入各试剂：1%甲苯酚兰酒精溶液1滴、0.5%硝酸银水溶液3滴，40%盐酸水溶液1滴，然后振荡试管，使溶液充分混合后，用移液管向试管准确的加入1%高锰酸钾水溶液0.15mL，振荡、混匀。

（3）对实验进行观察观察两次，第1次是反应后立即观察，第2次是反应后10min进行观察，以第2次为准，并记录。为了能清楚的看出反应变化，最好放在白色背景上进行。被检肉如果无毒素，浸出液呈红色或红褐色，经30min后变为无色；有细菌毒素时，浸出液呈蓝色或绿色，含量少时往往第1次观察时无色，第2次观察出现阳性反应，颜色的强度与肉中的细菌毒素的含量有关。

4 实验结果及结论

4.1 结果

用细菌内毒素呈色氧化反应法对4个市场共48份肉样分别进行了检测，结果为：侯台市场共12份肉样检出阳性率16.7%，其中猪、羊肉阳性率各为25%，牛肉未检出阳性。王顶堤市场共12份肉样检出阳性率25%，猪、牛、羊肉阳性率各为25%。杨柳青市场共12份肉样检出阳性率16.7%，其中猪、牛肉阳性率各为25%，羊肉未检出阳性。大寺镇市场共12份肉样检出阳性率33.3%，其中牛、羊肉阳性率各为25%，猪肉阳性率为50%。

4.2 结论

细菌内毒素呈色氧化反应法可用于肉品细菌内毒素的检测；此方法简便，不需培训，不需专业人士即可操作；快速，从采样到最后出结果只需不到20分钟。此方法是检测肉品细菌内毒素的一种好方法。

参考文献

[1] 吴扬,赵云燕.细菌内毒素检查法的应用进展[J].安徽医药,2004,8,(3):16-18.

[2] 梁前进.内毒素及其生物学效应[J].生物学通报,1997,9.

作者简介：王潇，男，就职于天津市津南区八里台镇动物防疫中心站，研究方向：动物防疫。