谈产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究

摘　要　通过用乙酰胆碱酯酶抑制法检测有机磷农药，从土壤中分离筛选出能降解敌敌畏的7个菌株，从其中降解能力较强的菌株OPD7提取胞内酶，并进行酶学性质的研究。结果表明，该酶分解敌敌畏的最适pH为7.0，最适温度为42℃，pH稳定范围为6-8，在低于47℃时稳定；该酶也能降解乙酰甲胺磷、甲胺磷、乐果和氧化乐果。

关键词　敌敌畏　有机磷农药降解酶  酶学性质

有机磷农药(Organophosphates，简称OPS)具有杀虫效率高、防治范围广、成本低等特点，在保护农作物免受病虫草害侵染、提高粮食产量等方面发挥了巨大作用，大大促进了农业生产^[1]，但同时它们也对人类赖以生存的环境造成了严重的污染，而且经常导致蔬菜和水果等农产品农药残留超标，直接危害人们的身体健康^[2]。因此，当前迫切需要建立一种用于治理环境污染、去除农产品的农药残留的有效方法。目前最有潜力的有效方法之一是生物技术的方法：利用能够降解农药的微生物来治理受农药污染的环境，利用农药降解酶来清除表面农药残留超标的农产品 ^[3]，其前提是培育出能高效降解农药的菌株和制备出高效的农药降解酶。为了实现用生物学方法来解决农药残留危害的目标，建立一种快速、简便、成本低的筛选农药降解菌并从中提取降解酶的方法，是当前生物学家首先要解决的重要任务。本文旨在探索一种分离筛选能高效降解有机磷农药的微生物的简单、快捷的方法，同时对有机磷降解酶进行初步研究，为解决农药残留所造成的危害问题提供生物学基础。 

1．材料与方法 

1.1 土壤的来源

土壤取自农药厂的排污水沟和附近的农田。

1.2  乙酰胆碱酯酶从家蝇头部提取。

1.3 培养基

富集培养基(%)：NaNO₃ 2，KCl 0.5,CaCl₂ 0.05 ，KH₂PO₄ 1，MgSO₄.7H₂O 0.5，pH7.0,使用前加入适量敌敌畏浓缩液。

分离培养基(%)：KH₂PO₄ 0.5，(NH₄)SO₄ 0.5，FeSO₄  O.001g，K₂HPO₄0.2， CaC1₂0.005 ,MgSO₄.7H₂O  0.2，使用前加入适量敌敌畏浓缩液。

发酵培养基(%)：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl 1.0， pH7.0。

1.4　菌株的富集、驯化和筛选

取2 g土样于100m1富集培养基中，加敌敌畏至100 mg/L， 37℃振荡培养24 h，所得菌液接入新的富集培养基中（接种量10%），并提高敌敌畏浓度到200 mg/L，24h后接入新的富集培养基中，敌敌畏终浓度提高至300 m g/L，如此循环至培养液中敌敌畏浓度达到500m g/L。然后，将培养液接入分离培养基（敌敌畏浓度为500mg/L）继续培养，一周后再移种一次。将富集所得菌液适当稀释，涂布于分离平板，观察是否有菌落生长，选择生长旺盛的菌落进行纯化。

1.5 敌敌畏降解酶粗酶液的提取

用发酵培养基培养菌体，离心收集菌体，用0.02mol/L, pH7.0的磷酸缓冲液洗涤后再离心，用适量磷酸缓冲液悬浮所得菌体，用JY92-II型超声波细胞粉碎机破碎细胞（工作电压220V，工作时间10S，间隔时间15S，120个循环），离心所得上清液即粗酶液。

1.6乙酰胆碱酯酶活性测定

乙酰胆碱酯酶能分解靛酚乙酸酯(红色)为靛酚(蓝色)和乙酸，靛酚的吸收峰在605nm，所以可以通过吸光度变化值来测定酶活力。

在试管中加入10μl 乙酰胆碱酯酶，470μl 0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液，20μl  2%靛酚乙酸酯，混匀，37℃水浴中反应5分钟，加入500μl  95％乙醇终止反应，测OD₆₀₅，计算酶活力。

1.7乙酰胆碱酯酶抑制法检测农药残留

在试管中加入470μl不同浓度的有机磷农药（对照管加dH₂O）, 10μl 乙酰胆碱酯酶，混匀，于37℃水浴中反应10分钟，加入20μl靛酚乙酸酯，混匀，37℃反应5分钟，加入500μl 95％乙醇终止反应，测OD₆₀₅。计算酶的抑制率，以农药浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标作出标准曲线。

抑制率的计算公式为:

I= (Uo一U_I) /Uo ×100%

其中 Uo：未受抑制的酶活力，

U_I：受农药抑制的酶活力。

1.8有机磷农药降解酶酶活力的测定

 取470μl粗酶液，加敌敌畏至1000 mg/L，37℃反应30分钟，沸水中加热5分钟终止反应，然后用酶抑制法测定农药残留。

酶活力单位定义： 在37℃，pH7.0的条件下，每分钟分解0.1µg敌敌畏所需的酶量为一个酶活单位(U)。

2.结果与分析

2. 1　菌株的筛选

通过驯化和筛选,分离出7株能降解敌敌畏的菌株。

2．2 有机磷农药降解酶在细胞上的定位

     菌液离心后取上清，将菌体重悬浮于0.05 mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液中，得菌体液，取其中的一部分进行超声波破壁，离心所得上清即为破壁菌液，分别测定上清、菌体液和破壁菌液的敌敌畏降解酶的酶活性，结果表明，只有破壁菌液有酶活性，这说明该酶是胞内酶。

2. 3　各菌株有机磷农药降解酶活力的测定

    破壁收集各菌株的粗酶液，测定酶活力，结果表明，菌株OPD7的酶活力最高（表1），所以选它来进行酶学特性的研究。

表1  各菌株有机磷农药降解酶的酶活力比较 

菌株         OPD1   OPD2    OPD3     OPD4     OPD5      OPD6      OPD7

酶活（U/ml） 126     88     132       165      103     150       196

2. 4  OPD7菌株的敌敌畏降解酶的酶学性质的研究

2.4.1 温度对酶活力的影响

在不同的酶促反应温度下测定酶活力，结果表明，最适反应温度为42℃，温度在低于42℃时，酶活性随温度的升高而上升(图1)。

图1  温度对敌敌畏降解酶活力的影响

2.4.2 酶的热稳定性

在不同的温度下处理酶液20分钟，测剩余酶活力，结果表明，在低于47℃时酶的稳定，但超过47℃后酶活力便急剧下降（图2）。       

                      图2  敌敌畏降解酶的热稳定性

2.4.3 pH对酶活力的影响

在不同的酶促反应pH下测定酶活力，结果表明，其最适反应pH为7.0，在pH 6-8的范围内相对酶活力均在90%以上（图3）。

                图3  pH值对敌敌畏降解酶酶活力影响

2. 4.5  酶的pH稳定性

     图4所示为酶的pH稳定性曲线，从图中可以看出，在不同的pH下保温20分钟后酶的相对活力变化很大，在碱性条件下酶活降低很多。

图4  敌敌畏降解酶的pH稳定性

2.4.6 酶的专一性的研究。

有机磷农药降解酶能够破坏有机磷的磷脂键而使其脱毒，由于各种有机磷农药的结构相似，只是取代基不同，所以通常一种有机磷降解酶可降解多种有机磷农药，所以我们进行了4种有代表性的有机磷农药酶促降解实验，结果表明，OPD7菌株所产的敌敌畏降解酶都能降解乙酰甲胺磷，甲胺磷，乐果，氧化乐果（表3），说明该菌株对有机磷农药的降解具有广谱性，值得进一步研究。

     表 3   敌敌畏降解酶对不同农药的降解

农药　　　　　   乙酰甲胺磷　　　甲胺磷　　　　乐果　　　　氧化乐果

起始浓度（mg/L）   400　　        250　　　　   500　　       200

　反应时间（分钟）　 10             10            10            10

  终止浓度（mg/L）　 50             105           80            40

降解率            87.5％          58％          84％          80％

3.讨论

目前国内已广泛采用胆碱酶抑制法来检测农产品的农药残留^[4,5,6]，该方法的最大特点是简单、快速，灵敏度也比较高，由于相关热词搜索： 菌株 降解 筛选 农药 性质