浅论黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶

摘要：本实验先采用正交设计法对黄孢原毛平革菌产木素过氧化物酶的培养条件进行优化，再通过放大实验对最佳培养条件进行验证，最终得出结果：最佳培养条件主要参数为：pH4.5、葡萄糖：10g/L、酒石酸铵：0.2g/L、吐温-80：0.2g/L。

关键词：黄孢原毛平革菌，木素过氧化酶，藜芦醇

黄孢原毛平革菌，(Phanerochaete chrysosporium，简称P. Chrysosporium)是一种丝状真菌,区别于单细胞微生物。菌对底物进行降解时,其次生代谢活动对反应环境的要求较为苛刻,需要一定的营养组分和严格的偏酸环境(pH约4.5左右)。其对底物（染料）的降解主要是依靠其次生代谢产物——胞外木素分解酶系。胞外木素分解酶系的发现是利用黄孢原毛平革菌降解木质素研究的重大进展。该酶系是一组同功酶，由两类酶构成：木素过氧化物酶（Lignin peroxidases，简称Lip）和锰过氧化物酶（Mn dependent peroxidases，简称Mnp）。kirkTK^[1]小组于1983年首次从黄孢原毛平革菌培养基中发现木素过氧化物酶，并发现该酶与赖锰酶（Mnp）、漆酶（Laccase）构成木素降解酶体系，该酶系有一个很重要的特点，就是它对底物的氧化是高度非特异性的，广泛研究表明，该菌可以降解多种染料，包括偶氮类、三苯甲烷类、杂环类、聚合染料等，在染料废水处理方面具有广泛的应用前景^[2]，目前该菌已成为这类研究的模型菌种。在国外，利用黄孢原毛平革菌降解各种结构各异的污染有机物已经成为一个非常热门的研究方向，他们已在木素降解酶系的生产、酶系的性质、酶系的分子生物学研究和利用酶系降解有机污染物方面作了大量的工作。而我们国内的研究却起步比较晚，开始于九十年代初，主要在木素过氧化物酶的生产条件和木素酶漂白纸浆废水方面进行了一些探索。^[3]

Pasti^[4] 已完成了 P. Chrysosporium 产生的 Lip对 22 种偶氮染料的氧化速率的测定。而且在整个合成阶段Lip的合成量要比Mnp大得多，再加上Lip能降解木质素的模型物，因此Lip在木质素的降解中起着主导作用，成为后来的主要研究酶。^[5] 本文主要通过对黄孢原毛平革菌培养条件进行优化--正交设计法对培养基组分进行优化，再通过放大实验对最佳培养基条件进行验证比较。从而最终确定对黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶最有利的培养基方案。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  试验材料菌种  黄孢原毛平革菌(中国科学院微生物所5.776)。

斜面培养基：马铃薯琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯煮汁1000mL，蔗糖20g，琼脂20g，pH4.8～6.0。

基本培养基：葡萄糖，酒石酸铵，吐温-80，以上成分的量按正交表设计添加。醋酸缓冲液10mmoL/L（pH4.5），KH₂PO₄ 2g/L，V_B1 1mg/L，0.5M藜芦醇溶液1.0mL/100mL，微量元素混合液70mL/L，注意此时分不同pH值（4.0、4.5、6.0）。

微量元素混合液（L^-1）：氨基乙酸：0.5g，MgSO₄·7H₂ O：3g，NaCl：11g，FeSO₄·7H₂O：0.1g，CoSO₄：0.1g，CaCl₂·2H₂O：0.1g，ZnSO₄·7H₂O：0.19g，CuSO₄·5H₂O：0.01g，AlK（SO₄）₂·12H₂O：0.01g，H₂BO₃ ：0.01g，Na₂Mo·2H₂O：0.01g，MnSO₄·H₂O：0.01g。

0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先于100～105℃烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

斐林试剂

1.1.2  仪器设备  温控摇床，太仓市华美生化仪器厂；紫外可见分光光度计（UV-9100），北京市瑞利分析仪器公司。

1.2  方法

1.2.1  基本培养条件  PDA培养基培养5d的菌丝体加入到无菌水当中，适当搅拌，进行孢子计数。然后按照不同的量接入到250mL三角瓶中，三角瓶装液量100mL，接种量（以孢子计）1.0×10⁶mL^-1；培养温度：37℃，转速：150r/min，培养6d。

1.2.2  酶活测定方法  木素过氧化物酶（Lip）活力的测定（用氧化黎芦醇的速率表示）。

1mL反应液中含0.2mL藜芦醇溶液、0.4ml酒石酸缓冲液（250mmoL/L，pH 3.0）、0.4mL培养液或稀释液、20μLH₂O₂溶液（20mmoL/L），于30℃反应2min，测310nm波长下的吸光度（ξ）变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化黎芦醇产生1μmoL/L黎芦醛所需的酶量。

1.2.3  葡萄糖残糖测定（斐林法）^[6]

1.2.4  菌体干重测  在发酵过程中，每隔一天时间从发酵罐中取一定体积的发酵液，用已称重的干燥滤纸进行过滤。而后将滤纸（连带菌体）在100℃左右烘箱中烘至恒重，减去滤纸重量，即得菌体干重。

1.2.5  放大培养  利用最优方案及比拟放大对该最佳方案进行放大试验，记录整个过程中pH、DO₂、残糖量、菌体干重、木素过氧化酶酶活的变化。

2  结果与讨论

2.1  确定最佳培养时间  在静置和摇床培养条件下测定黄孢原毛平革菌5.776产木素过氧化物酶（Lip）活力随培养时间的变化，结果如图1，Lip活力在第6d出现峰值，达到69.1U/L。Lip属于次级代谢产物，与菌体生长不同步^[7]，且Lip的合成与菌体生长是非偶联的。由此确定第6d是研究培养条件改变对Lip活力影响最适时间。^[8]

图1：对照酶活变化曲线

2.2  正交表的选择  选取pH、葡萄糖、酒石酸铵、吐温-80为考察因素，每个因素取3个水平，按正交表L9（3⁴）来设计实验^[9]，正交表如下：

表1   正交试验因素水平的安排^[10]

2.3  数据分析

从上述结果可以做出判断：在其它条件相同的情况下，培养基中碳源（葡萄糖）丰富时更有利于黄孢原毛平革菌产木素过氧化酶，相比其他，其酶活性高出2～3倍。同时，根据喻国策等^[11]的研究也表明，木质素降解酶的产生受氮浓度条件影响，低氮浓度有利于酶的产生，高氮浓度则抑制酶的产生。

2.3.1  数据处理与分析

表2  正交试验结果分析表

2.3.2  变量分析

表3  Lip活力方差分析表