鸡冠中透明质酸的提取

[关键词] 透明质酸；粘多糖；提取；纯化

1  引言

透明质酸（Hyaluronic acid）简称HA，是一种酸性粘多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质(基质)和某些细菌的荚膜中。Meyer和Palmer等^[1]人于1934年从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质，并随之命名为透明质酸。Kendell等于1937年从细菌体内提取到HA。在临床上，透明质酸用于视网膜脱离手术，是眼科手术中必备的药品^[2]；同时，透明质酸是理想的保湿因子，广泛用于化妆品中^[3]。

    HA的生产工艺主要分为两大类^[4][5]，以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。几乎所有的动物组织中均含有HA，只是含量不同，能够用于生产的原料主要为鸡冠和人脐带。从鸡冠中生产透明质酸具有广阔的市场^[6]。

1  工艺流程^[7][8]

2  操作要点

2.1  预处理  新鲜公鸡冠，投入丙酮中，浸泡24h至鸡冠变硬为止，然后置瓷盘中于干燥箱干燥，干燥后用粉碎机粉碎成粉状。

2.2  提取  将粉状物倒入烧杯中，加入6～7倍去离子水，搅拌均匀，静置浸泡过夜，使鸡冠粉充分溶胀，收集滤液，滤渣再按同样方法浸泡两次，合并滤液。

2.3  除杂物  将滤液移入烧杯中，不断搅拌加入10％的固体乙酸钠，完全溶解后，加入等体积的氯仿、正丁醇溶液（氯仿：正丁醇为4：1），搅拌三小时左右，然后静置分层，虹吸出上层水相（注意千万不可吸出氯仿、正丁醇）。

2.4  沉淀  将上述水相倒入另一烧杯中，不断搅拌加入2倍体积的95％乙醇，静置沉淀过夜，虹吸出上层乙醇溶液（可回收乙醇），过滤得沉淀物，干燥后即为HA粗品。

2.5  分离  将粗品溶于4倍体积的0.1摩尔/升乙酸钠溶液中，搅拌下用2％的三氟乙酸调节溶液的pH值至4.5～5.0，加入等体积的氯仿、正丁醇溶液，搅拌均匀，静置分层后，虹吸收集上层水相，再往水相中加等体积的氯仿、正丁醇溶液，静置分层后，吸出上层水相，移入另一烧杯中。

2.6  酶处理^[9]  在以上水相中，先用8％的NaOH溶液调节水相的pH值为7.5左右，加热至37℃恒温，加入链酶蛋白酶，保温过夜，得酶解液。

2.7  再次除杂物  在上述酶解液中加入等体积的氯仿、正丁醇溶液，搅拌均匀，静置分层后，吸出上层水相，水相再加氯仿、正丁醇溶液，按相同方法处理2次，合并上层水相，下层液体供回收氯仿用。

2.8  十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀将吸出的水相移入烧杯中，搅拌下加入等体积1％的十六烷基三甲基溴化铵溶液，静置过夜，滤除清液，收集沉淀物。

2.9  溶解  将十六烷基三甲基溴化铵的沉淀物用2～3倍体积的0.8摩尔/升氯化钠溶液搅拌解离30～40min，然后用离心机离心10min，除去沉淀，收集解离液。

2.10  乙醇沉淀  把解离液倒入烧杯中，搅拌下加入3倍体积的95％乙醇，静置沉淀7～8小时，虹吸除去上层乙醇液（供回收乙醇）。下层沉淀再加95％乙醇反复沉淀2次，收集下层沉淀物，吊滤至干。

2.11  干燥  将吊干的产品用丙酮洗涤2次，或放在真空干燥箱中干燥，至完全干燥即得精品。

3  工艺说明

①用去离子水提取透明质酸，可防止硫酸软骨素的混入，便于下一步纯化，收率较高。

②加链酶蛋白酶，分级沉淀等温和条件，可保持透明质酸的大分子特性，并有效地除去蛋白质和核酸等杂物。

③用乙醇沉淀透明质酸水提取液时，有纤维状和粉状两种沉淀产生，纤维状飘浮于乙醇上部，粉状在乙醇下部。但在强酸条件下，用氯仿处理提取液沉淀时，纤维状沉淀消失，溶液粘度明显降低。这说明纤维状沉淀与透明质酸大分子特性及溶液浓度有关。当溶液浓度小于0.05％时，透明质酸分子大多独立存在，当浓度大于0.1％时，部分交织成网状结构。据分析，这种网状结构物质沉淀下来呈现纤维状，部分散在的分子沉淀下来呈粉状。 

4  结束语

    应用酶解法从鸡冠中提取得到透明质酸，工艺简单，生产环节少，降低了对透明质酸的破坏，生产同一批号的透明质酸性能相近，说明工艺稳定可靠。

参考文献

[1]Meyer K, Palmer J W. The polysaccharide of the vitreous hourmor. [J] Journal of biology chemistry,1934,107:629-633

[2]徐积恩.透明质酸的应用开发和市场[J]，江苏食品与发酵，1996，1：27～29

[3]冯文帅.透明质酸及其发展应用前景[J]，四川食品与发酵，2001，1：4～6

[4]陈鹏，陆文雄，周勤夫等，透明质酸的应用及制备研究进展[J].上海大学学报(自然科学版)，1999，5（1）：69～73

[5]鲁念慈，谭天伟，透明质酸的制备及其应用[J].功能高分子学报，2001，14（3）：370～376

[6]张谦朋，赵子鹏，陈倩等，不同组织来源透明质酸的分离纯化及收率比较[J].聊城大学学报（自然科学版），2004，17（1）：51～53

[7]陈来同，唐运，41种生物化学产品生产技术[M].北京.金盾出版社，1994

[8]郭学平，凌沛学，王春喜等 透明质酸的生产[J].药物生物技术，2000，7（1）：61～64

[9]王大为，张艳荣，沙坤，中国林蛙皮多糖类天然保湿因子的提取与鉴定[J].吉林农业大学学报，2000，24（6）：99～102