论鸭疫里氏杆菌油乳剂灭活苗的创新研制

鸭疫里氏杆菌病（又称鸭传染性浆膜炎、鸭疫巴氏杆菌病）是雏鸭一种常见的急性败血性传染病。预防控制该病的方法是药物防治和菌苗接种，我们以本地分离株制备种子液，再将种子液接种鸭胚增殖培养，收获菌液经甲醛灭活后制备成油乳剂灭活菌苗，进行免疫攻毒试验，保护率为75.0%。在部分鸭场使用该菌苗，结果证明安全有效。
1   材料与方法
1.1   材料
1.1.1   菌种。制备菌苗的菌株分离自湖北黄梅县某鸭场，经鉴定后冻干保存。
1.1.2   鸭胚。由湖北神丹健康食品有限公司提供，自行孵化。
1.1.3   试验鸭。10日龄公雏鸭，购自某种鸭场，笼养，自由采食。
1.2   菌苗制备方法
1.2.1   种子液培养。将制苗的菌种以血清营养琼脂平板复苏后接种于加有10ml/L犊牛血清的改良液体培养基中, 37℃摇振培养20h，取培养液接种于血清营养琼脂和血液平板进行纯度检查合格后作为种子液，保存于2~8℃条件下备用，保存期不超过5d。
1.2.2   菌液的制备。将种子液按一定比例稀释后接种健康的12日龄鸭胚尿囊腔内，在37.8℃左右条件下孵化36小时，然后采用无菌操作收取尿囊液和胚体，捣碎后加入最终浓度为0.4%的甲醛溶液进行灭活30小时，并进行质量检测。
1.2.3   菌苗的制备。将灭活后菌液加入一定量的Tween-80(94∶6)混匀，使其充分溶解，作为水相。同时将10号白油缓慢加温，并按6%的比例加入Span-80，边加温边搅拌，搅匀后再按总体积2%的量加入硬脂酸铝，充分搅拌使其完全溶解，作为油相。将处理好的油相加入乳化罐内，在低速搅拌下缓缓加入水相搅拌，使水相、油相按一定比例混合，使每1ml菌苗中含菌数为200亿个左右，再按总体积加入最终浓度为万分之一的硫柳汞钠，在1000r/min转速下搅拌30min，使水油充分乳化，制成油包水型油乳剂。
1.3   菌苗无菌检查。将制备好的灭活油乳苗分别接种于普通肉汤培养基和血琼脂培养基中，37℃温箱中培养72ｈ，观察有无细菌生长。
1.4   菌苗安全性检查。取10日龄健康公雏鸭5只，颈部皮下注射菌苗，1ml/只，观察10天。
1.5   菌苗物理性状检查。用吸管吸取1ｍl保持垂直状态，记录放出0.4mL所需时间；观察菌苗滴于水中是否呈油滴状并且不分散；油乳剂灭活苗在3000r/min转速下离心15min后是否出现分层、破乳现象。
1.6   攻毒保护试验。将40只健康的10日龄公雏鸭随机分为2组，每组20只。试验组每只注射菌苗0.5ml，对照组不免疫。在免疫后第7天进行攻毒试验，每鸭皮下注射40亿个菌的种子液。攻毒后观察鸭的发病及死亡情况，并对攻毒鸭进行剖检观察。
1.7   田间试验。取该菌苗在湖北黄梅县部分养鸭场进行免疫试验，共免疫8~16日龄雏鸭3100多只，每只皮下注射0.5ml，定期跟踪观察。
2   结果
2.1   安全性检查。5只雏鸭观察10天全部健活，精神正常，食欲良好。
2.2   菌苗的物理性状。所制菌苗为白色均质乳剂，粘度为5.8ｓ，菌苗滴于水中呈圆的油滴状不分散，因此为油包水型，离心未出现分层、破乳现象。
2.3    攻毒保护试验。免疫组在10日龄免疫，17日龄攻毒，20只鸭，有15只建活，3只死亡，2只感染，保护率可达75.0%。对照组20只鸭全部死亡，将对照组病死鸭进行剖检，可见心脏、肝脏表面有一层白色的纤维素性包膜，心肌、心冠脂肪有出血，肝脏肿大出血，心包腔内填满淡黄色纤维素性渗出物等现象。
2.4   田间试验。在湖北黄梅县部分养鸭场使用菌苗接种后，雏鸭成活率比往年明显上升，产蛋鸭死淘率下降。
3   小结与讨论
3.1   从上面试验结果可知，从当地鸭场分离的菌株具有良好的免疫原性，采用上述方法制备的鸭疫里氏杆菌油佐剂灭活苗是安全有效的。
3.2   本次攻毒试验保护率为75.0%，若在制苗过程中加大菌苗中菌数含量或者选择增加适当免疫增强剂，则保护率还可以提高，这有待以后继续研究。据相关资料报道，鸭胚培养制备的菌苗保护率达100%，充分说明采用这种方法生产的菌苗保护效果较好。
3.2   由于鸭疫里氏杆菌的血清型越来越趋向多样化，国外已报道有21个血清型，而且各型之间缺乏交叉保护，给菌苗接种增加了难度。因此建议使用当地分离株制备菌苗，这样不仅可以有效地提高免疫针对性，还避免了困难的血清型鉴定。
参考文献：
[1] 胡青海，李刚，郑明球. 鸭疫巴氏杆菌的分离与鉴定.中国畜禽传染病，1997，19(5):13-15.
[2] 张大丙,郭玉璞.北京地区鸭传染性浆膜炎的流行病学调查[J].中国预防兽医学报,1999,21(4):260～263
[3] 唐晓丽，蔡家利. 鸭传染性浆膜炎免疫研究进展[J].中国家禽，2001，23(2):31-32 . 相关热词搜索： 乳剂 里氏 杆菌 研制 灭活