HPLC-ELSD法测定蜂蜜中的糖分博弈

作者简介：余娟（1984－），女，四川邻水人，广西大学轻工与食品工程学院硕士研究生，主要研究方向：糖品工业分析。 

摘要：本文建立了同时测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的高效液相－蒸发光散射检测方法。样品溶解后，采用Hypersil NH₂柱分离，以乙腈/水（80/20，体积比）为流动相，使用激光蒸发光散射检测器进行检测。结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的线性范围分别为15～1500、20～1000、5～500和5～500mg/mL，检出限为0.5～4 mg/mL，样品的加标平均回收率为92.4～98.5%，相对标准偏差为2.1～3.5%。该法用于实际样品的测定，结果令人满意。

关键词：高效液相色谱；蒸发光散射监测器；蜂蜜；果糖；葡萄糖；蔗糖；麦芽糖

中图分类号：TS207.3 

蜂蜜是一种传统的营养、保健食品，其主要成分是葡萄糖、果糖以及多种活性物质。经常食用蜂蜜，能提高人体的消化功能，止咳润肺，增强机体免疫能力。因此，蜂蜜具有较高的食用价值和药用价值。

2006年3月1日，我国首个蜂蜜强制性标准GB18796-2005^[1]正式实施。新标准要求，蜂蜜中果糖和葡萄糖总糖量应达到60%以上，蔗糖含量要求在5%以下。目前，蜂蜜中糖的测定方法主要有以下几种，一是以SN/T0852－2000出口蜂蜜检验方法为代表的化学法^[2]；二是以AOAC标准^3]为代表的气相色谱法；三是以AOAC标准和GB/T18932.22－2003为代表的液相色谱示差折光检测法（HPLC-RID）^[4]。另外，离子色谱脉冲安培法用于蜂蜜中糖的测定也略有报道^[5]。

化学法操作繁琐，无选择性，且测得的葡萄糖、果糖值比实际值略高，极有可能到影响蜂蜜品质的判断^[6]。气相色谱法则由于糖为未挥发性物质，需要进行衍生处理，操作繁琐。液相色谱示差折光检测法为较常用的方法，但存在示差折光检测器（RID）灵敏度低、基线噪音大、系统平衡时间长、不能进行梯度洗脱、有溶剂前伸效应、正负峰同时存在，且对室温敏感，易引起波动等缺点。相反，蒸发光散射检测器（ELSD）在测量半挥发或不挥发样品的光散射之前首先把流动相蒸发掉，所以检测器的响应不受溶剂和样品特殊性质的影响，因此对糖类的灵敏度大大高于RID^[7]。本文采用液相色谱法分离、蒸发光散射检测器检测，外标法定量测定蜂蜜中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的含量，结果准确，单个样品测定时间为20min。

1  材料与方法

1.1  仪器设备与试剂

Waters 600E 高效液相色谱仪；Alltech ELSD2000 检测器；Labconco90008-01超纯水仪；Sartorius METTLER TOLEDO AL204 电子天平等。

乙腈  色谱纯；葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖标准物质（均购于Sigma 公司）；实验用水  均为超纯水（电阻为18.2 MΩ·cm）。

1.2  标准溶液配制

     果糖、葡萄糖标准储备液：准确称取0.5g果糖标准物质和0.4g葡萄糖标准物质，精确至0.0001g，用乙腈+水（40+60）溶解定容到10mL容量瓶，摇匀，置于4℃冰箱中保存。

蔗糖、麦芽糖标准储备液：准确称取0.2g果糖标准物质和0.2g葡萄糖标准物质，精确至0.0001g，用乙腈+水（40+60）溶解定容到10mL容量瓶，摇匀，置于4℃冰箱中保存。

果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液：吸取不同体积的果糖、葡萄糖标准储备液和蔗糖、麦芽糖标准储备液，用乙腈+水（40+60）稀释至体积，配成不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液。

各种标准储备液的用量和定容体积见表1：

表1  标准工作溶液配制参照表

序号	果、葡储备 溶液体积/mL	蔗、麦储备 溶液体积/mL	定容体积/mL	标准工作溶液浓度/（mg/mL）
				果糖	葡萄糖	蔗糖	麦芽糖
1 2 3 4 5	0.2 0.3 0.4 0.5 1.5	0.025 0.05 0.1 0.2 0.7	1 1 1 1 2.5	10.0 15.0 20.0 25.0 30.0	8.0 12.0 16.0 20.0 24.0	0.50 1.0 2.0 4.0 6.0	0.50 1.0 2.0 4.0 6.

1.3  样品处理

准确称取样品5g，精确至0.001g。置于100mL烧杯中，加入30mL水，用玻璃棒搅拌使试样完全溶解，转移至100mL容量瓶中，然后再用10mL水洗烧杯三次并转移至容量瓶中，用乙腈定容，混匀^[4]。进样时用0.45μm的针头过滤器过滤供液相色谱测定。

1.4  色谱条件

色谱柱： 大连依利特 Hypersil NH₂柱（5 μm，250×4.6mm i.d.）；流动相：乙腈/水（80/20体积比，使用前经0.45μm滤膜过滤）；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；ELSD参数：漂移管温度100℃，氮气流速为2.5mL/min；进样量：15μL。

2  结果讨论

2.1  分析条件选择

经实验选择Hypersil NH₂柱作为分离柱，以乙腈/水为流动相。虽提高流动相中水的比例可以加快分离过程，但容易造成其中果糖和葡萄糖色谱峰的部分重叠，在兼顾分离速度和分离效果的基础上，我们确定了乙腈/水为80/20（体积比）为流动相，流速为1.0mL/min。采用ELSD对被分离成分进行检测，设定漂移管温度100℃，氮气流速为2.5mL/min。图1为此条件下标准品（A）和样品（B）的色谱图。

 图1  标准品（A）和样品（B）的色谱图

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2.2  线性范围和检出限

取一系列标准工作溶液15μL进样分析，以标准品峰面积对标准工作溶液浓度进行线性回归，得到4种标准品的回归方程和相关系数，见表2。以信噪比等于3为标准，测得果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的检出限，见表2。

表2  4种组分的回归方程及检出限

待测组分	线性方程	线性范围（mg/mL）	相关系数（R）	检出限（mg/mL）
果糖 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖	Y=1.43×107X－4.09×106 Y=1.47×107X－5.29×106 Y=1.14×107X－5.69×105 Y=8.51×106X－4.35×105	15～1500 20～1500 0.5～500 0.5～500	0.9990 0.9998 0.9987 0.9990	3 4 0.5 0.5

2.3  精密度实验

精密配制果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的浓度分别为20、16、2和2 mg/mL的混合对照品溶液，平行测定5次，计算各组分蜂面积的相对标准偏差（RSD%）分别为2.8%、3.2%、3.5%、2.1%。

2.4  回收率实验

在已知糖含量的蜂蜜样品中分别加入已知量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的标准溶液后，色谱条件不变，再次对样品进行平行测定5相关热词搜索： 糖分 博弈 蜂蜜 法测定 HPLC