论黄原酸盐高效降解菌的紫外诱变选育

 摘  要：黄原酸盐降解菌1＃经紫外线诱变选育后，筛选出突变菌株2＃，对未诱变菌株1＃和诱变菌株2＃进行了生物生长和降解性能实验，结果表明：紫外诱变的最佳时间是50秒,在pH为10,温度为30℃，振荡速率120r/min的培养条件下，3d内变异优势菌株2＃对含黄药废水的CODcr和黄药的去除率比未诱变菌株1＃分别提高38％和48％，变异菌株生长速度快。

关键词：黄原酸盐；生物技术；降解菌；紫外诱变；突变菌株。

作者简介：舒生辉（1980-），男，汉族，江西九江人，硕士研究生，主要研究方向：微生物工程在水污染治理中的应用。

基金项目：国家自然科学基金项目（50274034）

黄原酸盐俗称黄药（ROCSSNa），是有色金属硫化矿物（如PbS、ZnS、FeS2）浮选生产中最为有效的捕收剂。黄药具有恶臭，嗅觉值为0.05mg/L，即使浮选废水中残存量极少，也可使水质发臭，并严重影响附近水域的生态平衡，当CRocssMe=5mg/L,在3天内可杀死大部分鱼类[1]。黄药对人畜的危害主要表现在伤及神经系统和肝脏器官，对造血系统也有不良影响[2]。

据报道，目前国内该类废水中黄药的净化处理所采用的措施都是物理、化学氧化方法。用生物法降解黄药仅国外有少量报道，Solozhenkin 和Lyubavina 用荧光假单胞菌处理铅选厂含有0.12mg/L残存黄药的废水，悬浮处理5分钟后黄药就被全部分解了，试验表明黄药能被生物降解法有效地破坏。我们课题组的张萍也做了关于“一株盐生物降解菌的特性研究”，筛选出一株黄原酸盐降解菌，经鉴定为铜绿假单胞菌，实验表明：pH=8.0该菌株降解模拟废水中黄药的效率达95.7％，CODcr的去除率达到84.7％[3]，而南京某矿山锌精矿溢流废水的pH高达11.36，因此选育处理高pH黄药废水效果好的优势变异菌有重要的实践意义。

紫外诱变技术机理是紫外光照射能使微生物的脱氧核糖核酸（DNA）的分子结构形成“胸

腺嘧啶二原体”，造成复制错误，引起基因突变，从而获得高效降解活性的变异菌种[4]。

本研究利用紫外诱变技术诱变一株从南京某矿山锌精矿溢流废水驯化筛选到的黄药降解菌1＃选育出在高pH下对黄药有特殊降解功能的变异菌株2＃。

1  实验材料和方法

1.1  实验材料

1.1.1  菌种

南京某矿山锌精矿溢流废水经驯化筛选获得的降解黄药的菌种1#（菌种颜色为黄色，pH值为10.0时培养，pH值为11.0时培养不出目标菌）。

1.1.2  培养基及试剂

黄药选择性培养基：NaHCO3:0.80g，Na2CO3:3.60g，MgSO4:0.006g，CaCl2:0.1mg，NH4Cl:0.1g，黄药5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg，蒸馏水定容至100mL， pH值调制10.0。

葡萄糖/无机盐培养基（降解菌培养基）：在上述培养基的基础上添加葡萄糖0.02g。

固体培养基：牛肉浸膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂2.0g，于100mL蒸馏水。

富集培养基：牛肉浸膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，溶于100mL蒸馏水。

无菌生理盐水、无菌水

以上培养基和试剂在使用前均需经121℃、0.1Mpa下灭菌20min。

1.1.3  仪器设备

TU2100-紫外分光光度计；XJ－Ⅲ消解装置；721分光光度计；SPX－150BS－Ⅱ生化培养箱；冰箱；超净操作台；高压灭菌锅；80－2B电动离心机；pH计；JB－3型定时恒温磁力搅拌器；光学显微镜；摇床；15w紫外灯；漏斗、三角瓶、玻璃珠、滤纸。

1.2  实验方法1.2.1  微生物的富集培养以无菌操作将菌株1＃接种于50mL活化富集培养基中，30+1℃、120r/min好氧振荡培养24h后，将菌株1＃培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加人无菌生理盐水再离心洗涤。而后将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。并将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装人试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个/mL左右，作为待处理菌悬液。1.2.2  紫外诱变取4mL制备的菌悬液加到直径9cm培养皿内，放一无菌磁力搅拌子后置磁力搅拌器上，18w紫外线下28cm处照射。在正式照射前，先开启紫外灯10min预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～95S。操作均在红灯下进行。在红灯下分别取未照射的菌悬液（作为对照）和照射菌悬液各0．5mL进行稀释分离，计数活菌细胞数。取照射菌液2ml于液体培养基中（300mL三角瓶内装30mL培养液），120r／min振荡培养6h。取中间培养液进行不同程度的稀释（取0.5mL菌悬液＋4.5mL无菌生理盐水）稀释，取最后三个稀释度的稀释液于琼脂平板上，每个稀释度涂3个平板，每个平板加稀释液0.1mL，用无菌玻璃涂棒涂匀，30℃培养48h(用黑布包好平板)。1.2.3  紫外诱变杀菌曲线和诱变菌株生长曲线的测定生长曲线测定按文献[5]进行，杀菌曲线测定按文献[6]进行，并以以下公式计算致死RL=(n0-ni)/n0,其中n0和ni分别为处理前和处理后的活菌数，单位均为“mL-1”。1.2.4  正突变优势菌株的筛选及优势菌2＃去除废水中CODcr效果实验无菌操作分别取浓度0.5g/mL菌悬液（诱变菌株2＃、3＃、4＃和出发菌株1＃所配制）5mL，接种于含黄药100mg/L（模拟废水pH＝10.0）为唯一碳源的培养基50mL内，30+1℃、120r/min振荡培养，测定24h、36h、48h、72h后各培养基瓶内黄药的降解率和废水CODcr的去除率。2  实验结果与讨论2.1  杀菌曲线的测定及优势菌株2#的筛选紫外光照射时间和诱变菌致死率效应曲线见图1，优势菌株2#的筛选见图2。从图1可知，当紫外光照射时间在80s时，致死率接近100％；当照射时间在60s时，致死率在90％左右。由于致死率不能过高或过低，过低诱变效果不佳；过高则负变菌株增多，且总体存活率太少而无从选择[7]，一般选择致死率在75％～95％[14]最佳。由图1可知，最佳照射时间为50s。从图2可知，诱变菌株2＃、3＃、4#经过3d的对黄药废水的降解实验，出发菌株1＃对废水中黄药的降解率为30％，菌株3＃和4＃的降解率分别为60％和63％，而菌株2＃的降解率达到了78％，比出发菌株1＃的降解率提高了48％，说明菌株2＃为最佳优势菌株，对废水中黄药的降解性大大提高。    2.2  出发菌株1＃和诱变菌株2＃生长曲线的测定和废水CODcr的处理效果实验经紫外光照射的诱变菌体和未诱变菌体的生长OD600nm值测定见图3，废水CODcr的处理效果实验见图4。1234从图3可知，出发菌株1＃培养4.5h后进入对数生长期，到14h到达菌体的最大生长量，OD600达到了0.575。14－16.5h之间是稳定期；诱变菌株2＃培养1.5h后进入对数生长期，到11h到达菌体的最大生长量，OD600达到了0.581。11－17h之间是稳定期；说明诱变菌2＃在含黄药废水中的代谢速度比出发菌1＃快，对废水降解性大大提高。从图4可知，经过3d的降解试验，出发菌株1＃对废水中CODcr的去除率为28％，而诱变菌株2＃对废水中CODcr的去除率为66％，比菌株1＃的去除率提高38％。说明诱变菌株具有明显的降解效果。3  结论（1）紫外诱变的最佳照射时间为50s。（2）诱变菌株2＃只需培养1.5h就进入对数生长期，比出发菌株1＃快3个小时，且菌体生长大，代谢速度比出发菌1＃快，对废水降解性大大提高。（3）诱变筛选的菌种产生了3株正突变菌株，其中菌株2＃对废水中黄药的降解率达到了78％，比出发菌株1＃的降解率提高了48％。（4）诱变菌株2＃对废水中CODcr的去除率为66％，比菌株1＃的去除率提高38％.参考文献[1]赵玉斌.黄药、黑药、二号油在水体中的降解实验.黄金,1995(7):47.

[2]朱潜力.黄药废水治理的新工艺研究.有色矿冶,1997,13(1):53-54,59.

[3]张萍,孙水裕,徐劲.一株有机浮选药剂--黄原酸盐降解菌的特性研究.环境污染治理技术与设备,2005,22(2):53-55.

[4]罗建中,刘鸿,刘玉红.紫外诱变优势菌处理含氯废水.上海环境科学,2000,11(19):529-531.

[5]Fan SY(范秀容),Li GW(李广武),Shen P(沈萍).微生物学实验(第二版).北京:高等教育出版社,1989.[6]Sheng ZJ(盛祖嘉),Chen ZF(陈中孚).微生物学遗传学实验.北京:高等教育出版社,1982.[7]顾蕾,陆玲,袁生.红酵母原生质体制备及其紫外诱变育种的研究.食品工业科技研究与探讨,2004,4:60-65.