氯噻啉时间分辨免疫分析方法研究

摘要：基于多克隆抗体建立了氯噻啉的时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）方法。采用氯噻啉半抗原与卵清白蛋白（OVA）的偶联物包被96 孔板为固相抗原，与样品中游离的氯噻啉共同竞争Eu3+标记的抗氯噻啉抗体，用直接竞争法检测样品中的氯噻啉，在水和土壤中分别添加氯噻啉标准溶液，平均回收率为81.7%～103.8%，变异系数为3.9%～10%，符合农药残留检测要求，该TRFIA方法可用于环境与中氯噻啉残留高灵敏度检测。

关键词：氯噻啉 多克隆抗体 时间分辨免疫分析

中图分类号：S482 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）24-0000-00

氯噻啉（imidaclothiz）是我国公司自主研发一种新烟碱类杀虫剂，与常规杀虫剂没有交互抗性，因而可用于抗性治理，广泛应用于那些对有机磷类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类已产生抗性的农林业害虫的防治[1]。由于其具有高效、广谱、低毒等优点，氯噻啉使用量日益上升，不合理的使用也经常出现，对环境造成很大压力，因此，研制快速廉价、灵敏度高、稳定性好和筛通量大的检测氯噻啉残留的常规方法，加强对氯噻啉药物的检测和控制是一项刻不容缓的工作。

目前，有关氯噻啉残留检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC）[2-4]。但前处理过程比较繁琐，检测结果受样品净化、浓缩等步骤的影响，不适合进行批量样品的快速检测。而免疫分析技术具有很高的精确度、更灵敏的反应，更强的特异性、不高的技术要求、更短的检测时间和大批量测定等优点，越来越受到人们的重视。抗氯噻啉农药的多克隆抗体的酶联免疫分析技术（ELISA）也有报道[5]，然而该方法检测灵敏度不太理想。时间分辨免疫分析技术具有高灵敏性、高选择性、快速等优点，可以弥补普通ELISA免疫分析技术灵敏度的不足。本研究建立了氯噻啉的TRFIA残留检测方法，为环境与食品中痕量氯噻啉残留高灵敏检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

96孔聚苯乙烯荧光板（江苏省原子医学研究所）；95%氯噻啉原药（南通江山农药化工股份有限公司）；卵清蛋白（OVA）、正三丁胺、氯甲酸异丁酯（Sigma公司）；Eu3+标记盒为PerkinElmer公司产品；荧光增强液，（江苏省原子医学研究所）；碳酸盐缓冲液（CBS）：0.05M，pH 9.6；磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01M，pH 7.4；氯噻啉多克隆抗体为本实验自行制备；二甲亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氢钾、氢氧化钾等试剂均为分析纯。

1.2包被原的合成

氯噻啉的半抗原合成参照文献[5]，将合成的半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联通过混合酸酐法制备包被抗原。反应液用PBS在4℃下透析3天。根据三者在280 nm的摩尔吸光系数（ε）估算半抗原与载体蛋白的偶联比[10]：结合比=（ε偶联物-ε载体蛋白）/ε半抗原。

1.3 包被板的制备

包被抗原用0.05 M pH 9.6 CBS溶液稀释至5 μg /mL，加入到96孔微孔板中（100 μL /孔），4℃包被过夜，弃去包被液，加入封闭液，每孔200μL，37 ℃孵育2h，弃去封闭液，真空抽干，-20℃冷冻保存。

1.4 Eu3 + 标记抗体的制备

取适量的PBS溶解的抗氯噻啉的抗体，在4℃下碳酸盐缓冲液（0.05 M，PH 8.5）透析2次，每次24h，目的是除去溶液中NaN3并且转换成碳酸盐缓冲液。在碳酸盐缓冲液环境中用DTTA-Eu3+标记抗体。取0.5 mg上述透析的抗氯噻啉的抗体加入含0.2 mg 的DTTA- Eu3+的小瓶中，室温下磁力搅拌反应24 h。将Eu3 +标记抗体溶液加入到Sephadex G-50层析柱中，用含0.9% NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱。收集层析柱流出液（ 1mL/管），逐管测量其吸光值（A280 nm），合并峰管。以Eu3+标记试剂盒说明书提供的方法测定并计算抗体标记率。

1.5 回收率的测定

河水经过滤，添加不同浓度（0.05-0.5 mg/L）的氯噻啉标样，用含甲醇的PBS稀释，直接用于TRFIA测定。称取10g土壤，添加不同浓度（0.05-0.5 mg/kg）的氯噻啉标样，静置一段时间，加入40mL二氯甲烷进行超声提取，4000 r/min离心。取上清液20 mL减压浓缩，用含甲醇的PBS定容到10mL。每个处理设3个重复，各设一个空白对照，用建立的TRFIA法对样品进行分析。

1.6 分析测定

取准备好的酶标板，加入50μL的氯噻啉标准品或处理好的样品溶液到酶标孔中，加Eu3 + 标记抗氯噻啉抗体（50 mmol/L pH 7.4的PBS稀释）100μL，室温振荡孵育30 min，用含0. 1% 吐温-20的Tris-HCl（50 mmol /L pH 7.8）洗涤液洗6次。加200μL 增强液，振荡孵育5 min 后，用荧光检测仪进行测定。

2结果与分析

2.1包被原的鉴定

对氯噻啉半抗原、OVA及偶联物进行紫外全波长扫描，发现偶联物的紫外吸收光谱具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征，说明偶联成功，如图1所示。根据它们在280 nm波长下的摩尔吸光系数估算得到包被原的结合比为8.5：1。

2.2 Eu3 +标记率

Eu3+标记抗体溶液经Sephadex G-50层析，用离心管收集出现的第1洗脱峰，以PerkinElmer公司提供的Eu3+标准为参考，计算得出第1洗脱峰的Eu3+含量为22.4 μmol /L，蛋白质含量为4.7 μmol /L，即平均每个免疫球蛋白分子上标记了4.8个Eu3 +。

2.3标准曲线的建立

各参考标准品浓度以及荧光值建立氯噻啉的标准曲线，曲线方程为Y=-2.292X-3.0874， IC50为0.0447 mg/L，最低检测限为0.005 mg/L。 图2表明本试剂具有良好的剂量-反应线性关系。

2.4 抗体的特异性

用TRFIA在相同的条件下测定氯噻啉和结构类似烟碱类杀虫剂对抗体的交叉反应，计算各自的IC50和交叉反应率CR（表1），结果表明得到的抗体对氯噻啉有较好的特异性，与大部分杀虫剂的几乎没有交叉。

2.5 回收率测定

在河水和土壤中添加不同浓度的的氯噻啉标样，按照TRFIA进行回收率测定，检测结果见表2。在水和土壤中分别添加氯噻啉标准溶液，平均回收率为81.7%～103.8%，变异系数为3.9%～10%，符合农药残留检测要求。

3 讨论

本文基于多克隆抗体建立了氯噻啉TRFIA免疫分析方法。其灵敏度（IC50）较先前报道的ELISA[5]有了很大的提高（大约5倍），方法的抑制中浓度可达到0.0447 mg/L。可见TRFIA法检测氯噻啉比ELISA 法灵敏度上具有明显优势。时间分辨荧光免疫分析具有示踪物稳定、无放射性污染、灵敏度高、操作简便、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、标记物储存时间长等优点[6-9]，使得试剂标准曲线飘移小，更提高了试剂的稳定性和准确性。在研究抗体标记和发光过程中发现：抗体的浓度与标记效率和本底发光值成反比，高浓度标记抗体，能够提高灵敏度和降低本底，使我们建立方法所需要。本文建立的氯噻啉-TRFIA 法，与方松等人的报道在灵敏度上有了很大的提高，可以用于环境与食品中痕量氯噻啉的检测需求。

参考文献

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*通讯作者：洪霞，E-mail：hongxia19862@163.com

基金项目：江苏省科技型企业技术创新资金项目（BC2011188），江苏省自然科学基金青年基金（BK2012274），镇江市国际合作项目（GJ2012009），镇江市科技支撑计划项目（NY2013006）。