HMGB1/RAGE蛋白在食管鳞癌中的表达及临床意义

【摘要】 目的 探讨HMGB1/RAGE蛋白在食管鳞癌中的表达及其对食管鳞癌预后判定的作用。方法 以食管鳞癌旁正常组织40例为对照,免疫组化检测80例食管鳞癌组织HMGB1、RAGE蛋白的表达,分析HMGB1、RAGE表达与临床病理因素的关系及其对食管鳞癌预后的影响。结果 HMGB1、RAGE蛋白在食管鳞癌组织和正常鳞状上皮的阳性表达率分别为47.5%vs17.5%和72.5%vs42.5%,差异均具有统计学意义;HMGB1、RAGE蛋白的阳性表达与食管鳞癌浸润深度、淋巴结转移及TNM分期正相关(P<0.05),与癌细胞分化程度负相关(r分别为-0.51、-0.242,P<0.05);HMGB1和RAGE之间的表达呈正相关(r=0.35,P=0.001);HMGB1、RAGE蛋白阳性表达食管鳞癌患者预后较差,COX分析显示HMGB1蛋白为影响食管鳞癌预后的独立因素(HR=4.853,P=0.000)。结论HMGB1和RAGE蛋白的表达与食管鳞癌的临床病理学特征密切相关,HMGB1与其受体RAGE的结合可能参与了食管鳞癌的侵袭和转移,HMGB1可作为预测食管鳞癌预后的重要指标。

【关键词】 食管鳞癌;HMGB1;RAGE蛋白;免疫组化;预后

Expression and clinical significance of HMGB1 and RAGE in esophageal squamous cell carcinoma

XIE Wen-xi,WU Xin-yuan.Department of Oncology, The Affiliated Union Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China

【Abstract】 Objective To explore the expression of HMGB1 and RAGE protein in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) and their functions in the prognosis of ESCC. Methods We measured HMGB1 and RAGE protein expression in 80 specimens of esophageal carcinoma and 40 specimens of normol esophageal tissue with immunohistochemistry and analyzed the relationship between these protein expression and the clinicopathological parameters and explored the prognosis in ESCC. Results The positive rates of expression of HMGB1 and RAGE in specimens of esophageal carcinoma and normol esophageal tissue were 47.5%vs17.5%,72.5%vs42.5%, the difference had statistical significance.The expression of HMGB1 and RAGE were positively correlated with infiltration degree、lymphatic metastasis and TNM stage, negatively correlated with the degree of cancer differentiation(P<0.05); the expression of HMGB1 positively correlated with that of RAGE(r=0.35,P=0.001).The positive expression of HMGB1 and RAGE in ESCC indicated poor prognosis,COX regression indicated HMGB1 was an independent prognostic marker of ESCC. Conclusions HMGB1 and RAGE expression have close relations with the clinical pathophysiological characteristics in ESCC. Maybe the protein correlates with the local invasion and distant metastasis of ESCC. HMGB1 expression may be used as an important survival predictor in ESCC.

【Key words】 Esophageal carcinoma; HMGB1; RAGE protein; Immunohistochemistry; Prognosis

作者单位:350001 福建医科大学协和临床医学院肿瘤科

食管鳞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,易发生侵袭转移,预后较差,手术切除后总体5年生存率仅约25%左右[1]。高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1,HMGB1)是存在于真核生物细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白,能与糖基化终未产物受体(Receptor for advanced glycation end-products,RAGE)结合共同发挥生物学作用。新近研究报道[2]HMGB1/RAGE参与了多种肿瘤的侵袭及转移。本实验运用免疫组化探讨HMGB1、RAGE蛋白在食管鳞癌组织中表达,分析其与食管鳞癌临床病理参数的关系,旨在为其预后判断提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集福建医科大学附属协和医院2003年12月至2006年6月具有完整随访资料食管鳞癌存档石蜡标本80例及40例癌旁组织(距癌组织均在5 cm以上)。其中男57例,女23例,年龄37~78岁,中位年龄58岁,高分化鳞癌27例,中分化鳞癌24例,低分化鳞癌 29例。临床分期依据1997年国际抗癌联盟(UICC)TNM分期标准,I期10例,II期32例,III期30例,IV期8例;淋巴结转移41例,无淋巴结转移39例。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。

1.2 实验试剂 兔抗人HMGB1多克隆抗体(工作浓度1∶75)购自美国PTG公司,鼠抗人RAGE单克隆抗体(工作浓度1∶50)购自美国Santa Cruz公司,免疫组化试剂盒均购自北京中山金桥生物公司。

1.3 免疫组化 严格按照试剂盒说明书进行操作,用PBS液(0.01 mol/L, pH7.4)代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断 参照许良中等[3]评判标准:①HMGB1蛋白定位于细胞核,以细胞核出现棕色染色为阳性细胞。每片随机观察8个高倍视野(×200)计数癌细胞总数和表达的细胞个数,得出阳性细胞表达百分率≥30%为阳性(+),<30%为阴性(-);②RAGE蛋白定位于细胞膜及细胞浆,见淡黄色颗粒,明显高于背景为1分;较多棕黄色颗粒为2分;大量深棕色颗粒为3分。每片随机观察5个高倍视野(×200)计数癌细胞总数和表达的细胞个数,≤5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%~75%为3分,≥76%为4分,两项分数相乘。0-4分为低表达,大于5分为高表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 15.0统计学软件包进行统计学处理,采用Chi-square检验分析,两种蛋白表达相关性采用Pearson相关分析。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线分析,并用Log-rank(时序检验)进行检验,采用Cox回归(Wald检验)分析临床参数和HMGB1/RAGE蛋白表达对生存的影响。以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 HMGB1、RAGE蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况 HMGB1主要在癌细胞核内表达,在正常组织多数不表达(见图1 A-C);由表1可见,HMGB1蛋白在食管鳞癌组织和正常鳞状上皮的阳性表达率为47.5% vs17.5%,差异有统计学意义(P=0.000)。RAGE在正常食管鳞状上皮及癌组织均有不同程度表达,主要表达于细胞膜,细胞浆也有一定程度表达(见图1 D-F)。本实验结果显示RAGE蛋白在食管鳞癌组织和正常鳞状上皮的阳性表达率为72.5%vs42.5%,有统计学差异(P=0.000,见表1)。

图1-A 食管正常鳞状上皮中HMGB1阴性表达 ×400

图1-B 食管鳞癌组织中HMGB1阳性表达×400

图1-C 食管正常鳞状上皮中HMGB1阴性表达 ×400

图1-D 食管正常鳞状上皮中RAGE阳性表达 ×400

图1-E 食管鳞癌中RAGE低表达×400

图1-F 食管鳞癌中RAGE高表达×400

表1

HMGB1、RAGE表达与食管鳞癌临床病理参数的关系

临床病理特征HMGB1(例)

阴性阳性 P值

RAGE(例)

低表达 高表达 P值

年龄(岁)

≥60171816 19

<6025200.53524 210.499

性别

男263124 33

女1670.05215 80.061

组织类型

鳞癌组织423840 40

癌旁组织3370.00037 30.000

浸润深度

T111092

T2121 11 2

T3+419370.00020 360.000

淋巴结转移

N1122910 31

N03090.000 30 90.000

TNM分期*

Ⅰ期10082

Ⅱ期25725 7

Ⅲ期723624

Ⅳ期080.000170.000

分化程度*

低分化5241020

中分化1591410

高分化2160.03216100.000

2.2 HMGB1、RAGE蛋白表达与食管鳞癌临床病理参数的关系 由表1可见,80例食管鳞癌中,HMGB1的表达与患者的年龄、性别无关(P>0.05),随着浸润深度和TNM分期的增加而逐渐升高(r分别为0.567、0.671,P<0.05),随肿瘤分化程度的升高而降低(r=-0.51,p=0.032),淋巴结转移组HMGB1表达较无转移组高。同样可见RAGE的表达与患者的年龄、性别无关,与浸润深度、病理分期及是否伴淋巴结转移均呈正相关(r分别为0.427、0.539,P<0.05),与分化程度呈负相关(r= -0.242,P<0.05)。

2.3 HMGB1和RAGE在食管鳞癌组织中阳性表达的相关性分析 在食管正常鳞状上皮和鳞癌中HMGB1、RAGE的表达逐渐增高,二者之间呈正相关,其相关性有统计学意义(r = 0.35,P=0.001)。

2.4 HMGB1、RAGE蛋白表达与食管鳞癌预后关系的分析 所有病例均进行术后随访,其中17例失访,随访率78.75%,随访时间1~67个月。Kaplan-Meier生存曲线分析显示食管鳞癌组织中HMGB1和RAGE的表达与患者预后显著负相关(见图2、图3),Log-rank检验χ2值分别为20.345、4.741,P<0.05。继而行COX模型分析,以Wald卡方检验进行假设检验,逐步前进COX回归分析显示进入的协变量为HMGB1,其对应的回归系数为B=1.580,对应的相对危险度分别为Exp(B)=4.853,P=0.000。

图2 HMGB1与食管鳞癌预后关系生存曲线

图3 RAGE表达与食管鳞癌预后关系生存曲线

3 讨论

近年来,尽管食管癌的外科治疗技术有了长足进步,但因食管壁内有丰富的淋巴组织,部分食管鳞癌早期即存在广泛或跳跃性淋巴结播散,临床治疗效果仍相当有限,预后不甚理想。分子生物学研究的进展使食管鳞癌的预后判断更加丰富,一些分子标志如VEGF、COX-2、E-cadherin等表达对食管鳞癌预后的影响均在研究中得到证实[4]。HMGB1曾作为一类致炎细胞因子被证实在炎症感染中发挥重要作用[5]。而RAGE则是细胞表面分子中免疫球蛋白超家族的成员之一,被证明RAGE为HMGB1的唯一受体[6]。新近研究发现,HMGB1及其受体RAGE的协同过表达参与了多种肿瘤如胃癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等的侵袭转移[7]。

本实验结果显示HMGB1、RAGE在食管鳞癌组织中存在协同高表达(r=0.35,P=0.001),二者高表达与食管癌浸润程度、淋巴结转移及病理分期呈正相关,与分化程度呈负相关。Xiaoqin Du等[8]通过RT-PCR技术分别检测了宫颈鳞癌中HMGB1及RAGE的表达,结果也显示HMGB1和RAGE在癌组织中存在过表达,对宫颈鳞癌的侵袭转移有重要影响作用。Kuniyasu H等[9]对96例胃癌组织进行免疫组化检测,发现HMGB1和RAGE在胃癌组织中阳性表达率分别为85%和65%,并与侵袭深度和淋巴结转移呈正相关。由此可见,HMGB1、RAGE可能参与食管鳞癌的发展、侵袭转移。

HMGB1/RAGE促进肿瘤细胞的侵袭转移已经在某些方面得到证实。如激活HMGB1/RAGE可促进血管内皮细胞的增加并诱导血管内皮生长因子(VEGF)表达[10],抑制HMGB1在结肠癌的表达可抑制新生血管形成[11]。Huttunen HJ等[12]认为HMGB1/RAGE具有抗细胞凋亡的作用,协同作用于抗凋亡蛋白抑制Caspase-9和caspase-3的活性,抑制肿瘤细胞的凋亡和导致肿瘤的发生、生长。Taguchi等[13]研究发现,HMGB1/RAGE在细胞表面结合而激活细胞内p38MAPK和Racl,并通过激活细胞外ERK、JNK、AKT的活性及NF-κB等信号通路,促进肿瘤细胞的增殖、浸润、转移和诱导肿瘤的血管形成等。本研究生存分析结果显示HMGB1、RAGE阳性表达与食管鳞癌预后有关,COX回归分析提示HMGB1为食管鳞癌独立预后指标(HR=4.853,p=0.000),一定程度说明HMGB1/RAGE高表达患者预后较差。

总之, HMGB1和RAGE在食管鳞癌组织中都有高表达,同食管鳞癌的浸润转移密切相关,可作为食管鳞癌预后评估的参考,但有关HMGB1和RAGE在食管癌中的分子机制有待于进一步研究。

参 考 文 献

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