丹参注射液对小鼠Lewis肺癌P53、P16表达的影响

【摘要】 目的 观察丹参注射液对小鼠Lewis肺癌P53、P16表达的影响。方法 建立Lewis肺癌小鼠模型，用免疫组织化学方法检测丹参注射液对Lewis肺癌组织P53、P16表达的影响。结果 小鼠Lewsi肺癌细胞p53的表达在丹参注射液组的阳性率明显低于生理盐水组（P<0.01）。p16的表达在丹参注射液组的阳性率明显高于生理盐水组（P<0.01）。结论 丹参注射液能有效抑制肿瘤细胞p53的表达，增强p16的表达。

【关键词】 丹参注射液；Lewis肺癌；P53；P16

肺癌的发生与正常细胞中的原癌基因和抑癌基因有关。两者之间平衡失调对肿瘤发生起决定作用。中药的抗瘤机制是目前广大学者研究的热点。多数研究报道丹参据有抗肿瘤的作用[1]，但丹参注射液对lewis肺癌的抗肿瘤的机制尚在探讨中。p53、p16是与肿瘤发生、发展关系密切且相关报道较多的两种基因。本实验研究丹参注射对小鼠Lewis肺癌组织p53、p16表达的影响。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂 药物：丹参注射液（DS，正大青春宝药业有限公司，每支10 ml，相当于原生药15 g，批号0101156）。注射用环磷酰胺（CTX江苏恒瑞医药股份有限公司，每支200 mg，批号06052021国药准字H32020857）。兔抗人COX2多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法 ①动物：C57BL/6纯系小鼠，雄性 6～8周，20±2 g，60只，北京维通利华公司动物实验中心，动物许可证号：SCXK（京）20022003。在SPF级实验动物房内养殖。②瘤株：Lewis 肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院肿瘤研究所提供并传代保种；动物许可证号：SCXK（京）2004～0001，Lewis 肺癌维持在C57 BL/6小鼠体内，每2周传代1 次。③动物分组：取C57 BL/6小鼠60只，随机分为3组：盐水空白对照组、丹参组、环磷酰胺组，每组20只。各组间小鼠体重差异无统计学意义。④荷瘤动物模型的建立：取传代后14 d的Lewis肺癌瘤源小鼠，颈脱臼处死，固定于鼠板上，常规消毒，于超净工作台中，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜和坏死组织，在无菌平皿中剪碎，置组织研磨器中加4 ℃生理盐水，轻轻研磨过滤，制成瘤细胞悬液，0.4 %台盼蓝计数，细胞活力大于95%调整细胞为1 ×10 7/ml。以上述瘤细胞悬液0.2 ml于右腋部皮下注射，以建立模型。⑤给药方法：从接种肿瘤次日开始，盐水组日腹腔注射0.9%生理盐水0.2 ml，连续10 d；丹参组予丹参注射液20 mg/（kg·d）连续给药10 d；环磷酰胺组隔日一次给予环磷酰胺250 mg/（kg·d）共5次。

1.3 测定方法 给药10天后，次日脱颈椎处死小鼠，将肿瘤组织常规病理取材，SP 法免疫组化，结果由2 位病理学专家分别观察作出判断。

1.4 结果判定 P53阳性呈棕黄色颗粒，主要在肿瘤细胞核内表达。P16以细胞浆和（或） 细胞核染色呈棕黄色颗粒为阳性。结果采用半定量积分法：即根据每张切片的阳性细胞比及着色深浅积分，着色细胞比例占1/3为1分，占1/3～2/3为2分，占2/3以上为3分；着色程度，无着色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。然后根据二者乘积判断阳性等级，0分为阴性，1～2分（+），3～4分（++），4分以上（+++），以此计算阳性表达率。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

p53阳性细胞在生理盐水组数量较多，阳性信号表达强，呈棕褐色；丹参组阳性细胞数较少，呈棕黄色；CTX组阳性细胞数最少，阳性信号表达较弱，呈浅黄色。经统计学处理，生理盐水组LewiS肺癌细胞p53阳性率明显高于丹参组及化疗组（P<0.01）。

3 讨论

p53基因是DNA损伤的传感器，抑制细胞周期的介体和

细胞凋亡的诱发因子。它分突变型和野生型，突变型p53基因是癌基因，在细胞转化中起作用，野生型p53基因是抑癌基因（野生型P53蛋白的半衰期短，一般不能用免疫组化的方法检测）。突变型p53基因则丧失了抑癌功能，促进细胞转化与过度增殖导致肿瘤形成[2]。

p16基因抑制肿瘤的机制主要是：p16蛋白产物与细胞周期蛋白D竞争CDK4/6的结合，当p16与CDK4/6结合后，cyclinDCDK4/6复合物活性受到抑制，细胞分裂生长受阻。cyclinDCDK4/6复合物对pRB蛋白具有磷酸化作用，pRB被磷酸化后，其G1期停滞作用丧失，而pRB非磷酸化时，可阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞增生。p16通过抑制CDK4/6激酶的功能而使pRB不能磷酸化，使未磷酸化pRB增多而抑制细胞增生[3]。

我们现在进行了丹参注射液对小鼠Lewis肺癌p53、p16表达影响的实验研究，结果表明：小鼠Lewsi肺癌细胞p53的表达在丹参注射液组的阳性率明显低于生理盐水组（P<0.01）。p16的表达在丹参注射液组的阳性率明显高于生理盐水组（P<0.01）。说明丹参注射液能抑制肿瘤细胞p53的表达，增强p16的表达。

参 考 文 献

[1] 梁华，姜玉华，褚磊，等.丹参注射液对lewis肺癌小鼠移植瘤生长转移及VEGF表达的影响.现代肿瘤医学，2008，16（2）：177181.

[2] 柳德灵，林庆安，余英豪，等.肺癌组织中P53和Ki67的表达及意义.国际呼吸杂志，2012，32（16）：12561258.

[3] 孙佳，姜秀峰，惠富新.P16基因育肺癌关系研究进展.国际肿瘤学杂志，2010，37（11）：852855.