纳米铜IUD和TCu220C,IUD细胞毒性研究

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摘要：目的 评价纳米铜IUD 和TCu220C IUD的体外细胞毒性。方法 采用纳米铜材料IUD和TCu220C IUD，用细胞完全培养液做浸提介质分别浸提24 h、72 h制备相应浸提液，与L929细胞接触培养，通过采取MTT（四唑盐）比色法测定细胞毒性和倒置显微镜观察细胞形态来进行毒性评价。结果 纳米铜IUD细胞毒性分级为1～2级，TCu220C IUD细胞毒性分级为2～4级。结论 纳米铜IUD较TCu220C IUD对细胞生长情况影响小，细胞相容性更好。

关键词：纳米铜IUD； TCu220C IUD； 细胞毒性；MTT

Abstract：Objective To evaluate the cytotoxicity of nano-copper IUDand TCu220C IUD with mouse fibroblast cells. Methods Leaching liquors of nano-copper IUD and TCu220C IUD were prepared with Cell culture fluid. The proliferation of L-929 cells was measured by tetrazolium colorimetric assay （MTT）， and the morphology of the cells were observed by inverted microscope. Results The cytotoxicity of nano-copper IUD group was 1～2， but the TCu220C group was2～4. Conclusion Nano-copper IUD present more cytocompatibility.

Key words：Nano-copper IUD； TCu220C IUD；Cytotoxicity； MTT

宫内节育器由于具有长效、简便、经济、避孕效果好、取出后能很快恢复生育能力等特点，深受广大育龄妇女的欢迎[1]。我国使用最多的宫内节育器是含铜节育器[2]。但目前市面上的含铜宫内节育器均存在置入后出血、疼痛等副反应，进而影响宫内节育器的被接受性和使用年限。低密度聚乙烯/纳米铜复合材料是采用物理和化学方法研制出的一种新型宫内节育器材料，本文采用MTT法比较低密度聚乙烯/纳米铜复合材料IUD（简称纳米铜IUD）和TCu220C IUD的细胞毒性，为新型含铜宫内节育器的应用和推广提供参考依据。

1 资料与方法

1.1材料 纳米铜IUD（纳米铜含量为30%的变异T型IUD），由华中科技大学材料与工程学院提供；对照材料TCu220C IUD，无锡市医疗器械厂生产；细胞株：小鼠成纤维细胞L-929，购买于武汉大学中国典型培养物保存中心；RPMI1640培养基（改良型）（Hyclone 美国），小牛血清（GIBCO 美国），胰蛋白酶（Amresco），MTT粉剂 （Sigma 美国），二甲基亚枫DMSO （Sigma 美国）。

1.2浸提液的制备 将纳米铜IUD和TCu220C IUD紫外线无菌[3]处理以后，依照GB/T16886.12浸提液的制备标准（样品质量/浸提液=0.2g/ml），用FBS- RPMI1640培养液作为浸提介质，分别放入37℃培养箱中浸提24 h、72 h，制备浸提液，过滤备用。阴性对照溶液：FBS- RPMI1640培养液。阳性对照溶液：浓度为 6.4g/ml的苯酚溶液。

1.3 MTT实验[4] 将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞接种密度为5000个/孔[4]接种于96孔板上，每孔100 μl，每板接种60个孔，重复接种3板，待细胞贴壁后吸去原培养液，0.01 mol/L的PBS清洗后，分别加入纳米铜和TCu220C IUD制备的浸提液、阳性对照液和阴性对照液，每组设5个复孔，每孔100 μl。在加入干预溶液后的第1 d，第3 d，第5 d分别取出一板，倒置显微镜观察细胞数量和形态后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，再放置培养箱中继续培养4 h，吸掉原培养液，用0.01 mol/L的PBS清洗后每孔加入150 μl DMSO，室温避光15 min，用酶联检测仪检测细胞光密度值（OD值），实验波长为492 nm，参比波长630 nm，计算各浓度光密度值（OD值）的平均值。

按以下公式计算细胞相对增殖率。细胞增值率与细胞毒性的关系见表1。

实验结果为0级～1级的为合格，结果为2级反应的应结合细胞形态观察，结果为3～5级的为不合格[4]。

2 结果

2.1倒置显微镜细胞形态观察 加干预液前用倒置显微镜观察，各孔细胞贴壁伸展，形态正常，胞体呈梭形或不规则三角形。加入干预液培养后24 h观察，阴性对照细胞形态良好，为长梭形和多角形，可见圆形分裂细胞，表明细胞生长旺盛（图1）；阳性对照组存留细胞多数形态异常，核皱缩或溶解，偶见细胞影像及崩解产物（图2）。用72 hTCu220C浸提液干预24 h可见细胞见少量絮状物，贴壁的细胞约占观察视野的75%～85%，部分贴壁细胞发生变形，高倍镜下可见细胞内出现较多黑色颗粒，部分细胞体积变大或皱缩，有胞质溢出（图3）；第3 d，第5 d贴壁细胞约占整个视野的35%～45%。72 h TCu220C浸提液干预后有少量漂浮的死细胞和絮状物，贴壁细胞中有约30%的细胞呈圆形。24 h纳米铜浸提液干预后有10%～20%的细胞呈圆形，偶可见漂浮死细胞，细胞数量有增加但增加幅度不及阴性组。MTT染色后， 阴性对照组可见大量密集的蓝紫色针状结晶（图4），阳性对照组仅有少量结晶沉积。

2.2不同浸提液中细胞增殖率及毒性分级 不同组别的细胞相对增殖率和毒性评级结果见表2。纳米铜浸提72 h干预5 d发现有轻度细胞毒性，TCu220C浸提24 h、72 h时细胞毒性分别为2～3级和3～4级。

3 讨论

L929是具有传代容易、繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，1982年美国质量标准协会将L929推荐为细胞毒性试验中的标准细胞。本试验采取MTT比色法是一种新的快速评定细胞增殖和细胞毒性的比色法，目前在国际上已广泛地应用于免疫学，肿瘤学和医用生物材料的生物相容性评价[5]。

含铜IUD的避孕效果主要依赖于铜在宫腔内腐蚀而释放出的铜离子[2]。所以铜的腐蚀会影响到含铜IUD的避孕效果和长期使用。有研究表明，纳米铜材料中铜的腐蚀与含铜IUD中铜的腐蚀过程是相同的[6]，而且本实验所使用的纳米铜材料中纳米铜粉是均匀分布在复合材料内部的，外界溶液通过复合材料中的微孔进入材料内部与纳米铜接触发生反应产生铜离子，铜离子进入溶液后发挥细胞毒性作用[7]，而不是纳米铜直接作用于细胞[8]，所以纳米铜材料浸提液中铜对细胞的作用机制与TCu220C浸提液中铜对细胞的作用机制是一样的，两者具有可比较的条件。

前期研究[9，10]提示金属铜释放的铜离子对中国仓鼠卵巢细胞有一定的细胞毒性，含铜 IUD 因含铜面积不同，其表现出来的细胞毒性也不同，含铜面积越大，细胞毒性越大[6，10]。而纳米铜材料的特殊结构使得材料中铜颗粒的腐蚀速率是可控的，在理论上不仅避免了一般的含铜IUD在置器初期发生的爆释现象[11]，而且对细胞毒性的影响也是可以控制的，所以在临床应用前景上纳米铜材料更有优势。

本次的细胞毒性实验中，纳米铜IUD浸提液的细胞毒性处于1～2级，TCu220C IUD细胞毒性分级为2～4级，说明纳米铜IUD对细胞生长情况影响较TCu220C IUD小，细胞相容性更好，可以对其在临床上的使用起到可靠的指导作用。

参考文献：

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[4]国家质量技术监督局.2005.G B/T 16886.5- 2005医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性实验[s].北京： 中国标准出版社，2003.

[5]张川川， 蒋学华， 奚廷斐. TCu220C与TCu380A IUD体外细胞毒性研究[J].中国计划生育学杂志，2008，153：410-412.

[6]Shouzhou Cai， Xianping Xia， Changsheng Xie. Corrosion behavior of Copper/LDPE nanocomposites in simulated uterine solution[J].Biomaterials， 2005，26 （15）： 2671-2677.

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[11]Shouzhou Cai， Xianping Xia， Changsheng Xie. Material nano-Cu/low-density polyethylene used for intrauterine devices[J].Contraception， 2004，70：153-157.

编辑/周芸霏