比索洛尔对高血压左室肥大大鼠心肌细胞GRK2表达的影响

摘要：目的 观察比索洛尔对大鼠肥大心肌细胞G蛋白受体激酶2（GRK2）的影响，探讨比索洛尔改善心肌重塑的可能机制。方法 以自发性高血压心力衰竭大鼠（SHR）为研究对象，通过免疫荧光标记、共聚焦显微镜及Werstern Blot等方法，检测比索洛尔干预后SHR左心室心肌细胞中GRK2的表达及其分布。结果 心肌总蛋白中GRK2表达6月龄SHR组和WKY组比较无明显变化（60.7±1.9，62.1±2.2，P>0.05），8月龄SHR比6月龄SHR显著增加（78.5±2.1，60.7±1.9，P<0.05），均有心肌细胞膜上的聚积，8月龄SHR药物组比非药物组显著减少（65.9±2.2，78.5±2.1，P<0.05），心肌细胞膜上聚积减少。结论 在心肌肥大的过程中，GRK2表达增加且有心肌细胞膜（闰盘）上的聚积，说明GRK2与心肌肥大关系密切，参与心肌肥大细胞信号途径的调控；比索洛尔抑制心肌细胞GRK2的表达以及细胞膜上的聚积，提示改善心肌肥大细胞信号途径的调控可能是比索洛尔逆转心脏重塑的机制之一。

关键词： 高血压；心肌肥大；信号传导；比索洛尔；G蛋白偶联受体激酶2；大鼠

中图分类号：R544.1 R285.5 文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.09.037 文章编号：1672-1349（2014）09-1103-03

Effects of Bisoprolol on Expression of GRK2 in Cardiac Myocytes of Hypertrophic Ventricle

Zhao Ting，Wei Xiaoliang，Lin Xiufang，et al

Fifth Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University （Zhuhai 519000）

Abstract：Objective To investigate the effects of bisoprolol on GRK2 in the pathogenesis of hypertensive ventricle hypertrophy.Methods The expression and subcellular localization of GRK2 in the cardiac myocytes of left ventricle were determined by immunofluorescent labeling，confocal microscopy，and Western Blotting in 8-month-old spontaneously hypertensive heart failure rats （SHR） fed with bisoprolol 2.5 mg/（kg·d）from 6-month-old.Results There was no obvious difference of GRK2 expression between 6-month-old SHR and WKY rats （60.7±1.9，62.1±2.2，P>0.05）.But the expression of GRK2 in 8-month-old SHHF rats was increased in comparison with that both 6-month-old SHR （78.5±2.1，60.7±1.9，P<0.01） and 8-month-old SHHF rats fed with bisoprolol （65.9±2.2 vs 78.5±2.1，P<0.01）.Membrane translocation of GRK2 was increased in 6，8 month-old SHHF rats，but decreased in 8 month-old SHR fed with bisoprolol.Conclusion GRK2 might play a role in the cell signaling transduction leading to cardiac hypertrophy.One of mechanisms in bisoprolol improving cardiac remodeling might inhibit the expression and membrane translocation of GRK2 in the cardiac myocytes.

Key words：hypertension；bisoprolol；G-protein-coupled receptor kinase2；cardiac hypertrophy；signaling transduction；rats

高血压左心室肥厚是心血管疾病的重要危险因子，高血压导致心肌细胞肥大、心脏重塑，最终导致心力衰竭、心源性死亡的发生，心衰引起机体交感神经的紧张性增强，β受体密度和功能下调，G蛋白受体激酶2（GRK2 ）的表达和酶活性增强[1]，且在肥大心肌亚细胞结构中发现GRK2的重新定位[2]，说明GRK2可能参与了心肌肥大时心肌细胞信号的传导。有研究报道β受体阻滞剂影响改变心肌中GRK2的表达和活性，但缺少对心肌细胞内亚细胞结构GRK2的分析[3，4]。本研究检测比索洛尔干预自发性高血压心力衰竭大鼠（SHR）左心室心肌细胞中GRK2的表达及其亚细胞分布，探讨比索洛尔抑制心脏肥大的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 6月龄Wister-Kyoto（WKY）大鼠，6月、8月龄SHR大鼠和6月龄药物组SHR大鼠，予喂养2个月的比索洛尔2.5 mg/（kg·d）至8月龄（8M-SHR-D组），各组大鼠数为12只，均购买于成都达硕科技有限公司，药物放于水槽中让大鼠饮入。兔抗GRK2（C-15）单克隆抗体、辣根过氧化酶标记鸡抗兔抗体、Alexa Flour 488标记牛抗兔抗体、Luminal发光试剂盒均购买于美国Santa Cruz生物技术公司，磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂均购买于美国Sigma公司，膜蛋白抽取试剂盒购买于美国Pierce公司。

1.2 实验步骤 ①左心室组织分别提取为总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，然后分别取这4种蛋白上样量25 μg，应用SDS-PAGE电泳，将蛋白电转到NC膜上，X线胶片曝光记录；②将左心室冰冻切片成厚6 μm的组织片，行GRK2免疫荧光标记，并在荧光显微镜下观察，将其结果与Western-Blot结果做比较。上述方法具体步骤参照文献进行[5]。

1.3 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 10.0软件分析。多组均数间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组均数间比较采用LSD检验。P<0.05表示有统计学意义。各组大鼠左心室重量与左心室组织蛋白中GRK2的相关性用Pearson检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠左心室重量比较 与6M-WKY组相比，6M-SHR组的心脏重量、心脏重量与体重比以及左心室重量均明显增加（P<0.05）。8M-SHR组三项心脏重量指标进一步增加，与6M-SHR组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与8M-SHR组相比，8M-SHR-D组能使3项心脏重量指标明显减少（P<0.05）。详见表1。

表1 各组大鼠心脏重量指标比较（x±s）

2.2 GRK2在心肌组织总蛋白中表达 与6M-WKY相比，6M-SHR心肌组织中GRK2的表达无明显变化（P>0.05）。8M-SHR心肌组织中GRK2的表达显著增加，高于6M-SHR组和6M-WKY组（P<0.05）。比索洛尔干预后的8M-SHR-D组心肌组织中GRK2的表达显著减少，均低于8M-SHR组（P<0.05），但高于6M-SHR组和6M-WKY组（P<0.05）。详见表2。

表2 GRK2在心肌组织中的表达（x±s）

2.3 GRK2在心肌组织浆蛋白中的表达 与6M-WKY组相比，6M-SHR组心肌组织浆蛋白中GRK2的表达无明显变化。8M-SHR组心肌组织浆蛋白中GRK2的表达显著增加，高于6M-SHR组（P<0.015）和6M-WKY组。8M-SHR-D组心肌组织浆蛋白中GRK2的表达显著减少，低于8M-SHR组

、6M-SHR组（P<0.05）。详见表2。

2.4 GRK2在心肌组织膜蛋白中的表达 与6M-WKY相比，6M-SHR组心肌组织中GRK2的表达显著增加（P<0.05）。8M-SHR组心肌组织中GRK2的表达进一步增加，高于6M-SHR组和6M-WKY组（P<0.05）。8M-SHR-D组心肌组织中GRK2的表达显著减少，均低于8M-SHR组和6M-SHR组（P<0.05） 。详见表2。

2.5 GRK2在心肌组织核蛋白中的表达 Western-Blot检测结果显示在分子量80 kDa处未见表达条带，提示左室心肌组织核蛋白匀浆中无GRK2的表达。

2.6 SHR大鼠左心室组织中GRK2表达的部位及亚细胞定位的变化 荧光显微镜观察发现各组大鼠心肌细胞核内均基本无GRK2绿色荧光。随着月龄增加，心肌细胞膜（闰盘）GRK2荧光逐渐增强，其中8M的SHR中心肌细胞膜（闰盘）上荧光最强，比索洛尔干预后8M 的SHR-D荧光强度变弱。进一步证实GRK2在SHR左心室心肌细胞膜（闰盘）的聚积。

2.7 各组大鼠左心室重量与左心室组织蛋白中GRK2的相关性 左心室重量和左心室心肌组织总蛋白匀浆GRK2水平（r=0.31；P=0.15）、浆蛋白匀浆GRK2水平（r=0.42；P=0.082）无明显线性相关，但与膜蛋白匀浆中GRK2水平（r=0.91；P<0.001）之间呈正相关。

3 讨 论

高血压病心肌肥大是心肌细胞对多种病理刺激的一种适应性反应，涉及细胞内多条信号转导通路的复杂病理生理过程[1]。GRK2与心肌肥大的细胞信号转导通路有密切联系。

本研究发现6月龄、8月龄SHR左心室已出现GRK2在细胞膜（闰盘）聚积的表现，这与文献报道的一致[2-5]，随着月龄的增加，GRK2表达增加，且心肌组织总蛋白、浆蛋白和膜蛋白中GRK2，仅膜蛋白GRK2与左室组织呈正相关性。闰盘是调节肥大心肌纤维结构的重要信息交汇中心，细胞膜骨架结构上也存在多种细胞信号分子以及骨架蛋白，在GRK2和骨架蛋白相互作用的信号级联反应事件中发挥重要的作用。研究表明P38是种有丝分裂蛋白激活酶（MAPK），参与细胞纤维重塑，GRK2调控P38活化水平，进而影响P38介导的细胞内效应[6]。这表明GRK2表达的增强以及细胞膜上GRK2的聚积与心肌细胞内多种信号因子相互作用参与心肌肥大的信号转导。因此推测干预细胞中GRK2可能达到抑制心肌肥大的作用。

Philip等[7]报道敲除GRK2基因的大鼠不仅阻止在缺血后的心肌异常重塑，而且保存了对β受体的反应性，增强心肌收缩力。Scot等[8]也发现GRK2表达缺失的大鼠心肌对β受体激动剂的敏感性增强。Hideo等[9]对表达GRK2阻滞剂（βARKct）转基因鼠先予主动脉狭窄术处理后造成后负荷压力增高，结果发现βARKct表达越强，心脏结构重塑及功能恶化程度越弱，并且保持了腺苷酸环化酶（AC）的活力和心肌细胞膜上β受体的密度。这些研究表明心肌细胞重塑与GRK2下调心肌细胞膜上β受体的密度有关。

比索洛尔是一种选择性的β1受体阻滞剂，能上调β受体，在高血压、心肌肥大、慢性心力衰竭等方面有重要的价值，但其改善心肌重塑的机制目前尚不明了。β受体阻滞剂能改变GRK2的表达和活性，在慢性主动脉瓣反流的大鼠[4]等研究中均发现β受体信号传导途径受损，GRK2水平升高，β受体阻滞剂能上调β受体的密度和数量，降低GRK2水平；在人心衰研究发现β受体阻滞剂能影响右心耳中GRK2的水平[3]。但这些研究缺乏对心肌细胞亚细胞结构上GRK2的分析。比索洛尔可以抑制左室重塑，并且心肌组织中GRK2的表达减少，GRK2在细胞膜上易位减轻。原因可能为GRK2是一种细胞溶质的酶，由胞浆易位到细胞膜实现GPCRs受体信号调节的关键步骤，当受激动剂刺激后，实现GRK2的细胞膜易位[10]。因此抑制心肌细胞GRK2的表达，尤其是抑制GRK2易位于细胞膜上，可能是比索洛尔阻止心肌细胞的肥大机制之一。

GRK2参与心肌细胞肥大的信号转导，比索洛尔可能通过干预GRK2信号途径从而抑制心肌肥大。这从细胞和分子水平上为逆转左心室肥大提供了新的理论和实验依据，也为临床防治高血压左心室肥厚提供了新的防治思路。

参考文献：

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[10] Viappiani S，Nicolescu AC，Holt A，et al.Activation and modulation of 72 kDa matrix metal1o Droteinase 2 by peroxynitrite and glutathione[J].Bioehem Pharmacol，2009，77：826-834.

作者简介：赵婷，女，住院医师，现工作于珠海市中山大学附属第五医院（邮编：519000）；危小良、林岫芳（通讯作者）、黄茵、王成山，工作于珠海市中山大学附属第五医院（邮编：519000）。

（收稿日期：2014-06-12）

（本文编辑 王雅洁）