基质金属蛋白酶在心肌缺血再灌注损伤中的作用

收稿日期：20050120

作者单位：100853，北京市，解放军总医院老年心内科（曹泽玲、叶平）；10085 0 北京市，军事医学科学院毒物药物研究所（汪海）

作者简介：曹泽玲，女，山东省威海市人，在读博士研究生，主治医师。

通讯作者：叶平，E－mail：yeping@sina.com；汪海，E－mail：wh@nic.bmi.ac.cn

缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）损伤一直是心肌缺血治疗难以解决的问题，到目前为止，临床用来治疗心肌缺血的药物均存在不同程度的副作用。因此寻找I/R损伤治疗新的作用靶点以开发应用新药物具有重要实用价值和临床意义。近年研究表明，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）在多种心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌梗死、心衰心室重构、动脉损伤后新生内膜形成中发挥重要作用［1］，有望成为治疗心血管疾病的药物靶点。从1962年Gross和Lapiere首次报道胶原酶(collagenase)以来，已有20多种MMPs被发现和纯化，新近研究表明，MMPs也参与血小板聚集、心肌I/R等急性过程。在缺血心肌几乎所有细胞如白细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、心肌细胞均可合成和分泌MMPs。现将目前已知与心肌I/R有关的MMPs综述如下。

1MMPs概述

MMPs是酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族，每种MMPs的氨基酸序列中都含有前肽、锌离子和体外连接素3个决定簇。前肽决定簇含有高度保守性半胱胺酸开关序列，使MMPs处于失活状态，各种MMPs以酶原形式分泌到细胞外后，在其他酶的作用下前肽裂解而激活。锌离子决定簇即催化区，为高度保守含锌功能区，可促进酶与底物的结合而维持酶的活性，且常是MMP抑制剂作用的主要部位。体外连接素则决定酶底物的特异性，通过裂解前肽区半胱氨酸与锌离子的结合,即打开“半胱氨酸闸”,从而暴露出锌离子活性中心。已经证明MMPs的激活机制主要在基因转录、激活MMPs潜在前体和通过其特异性抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMP)灭活MMPs 3个水平上受多种因素调节。

MMPs按其作用底物不同分为5类: (1)间质胶原酶 (collagenases):包括MMP1、MMP8、MMP13、MMP18，是降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ、Ⅴ、Ⅸ等间质胶原起始酶和限速酶。已知MMP1、MMP8 作用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原3条α链上同一位点而产生两个分别占3/4和1/4长的A和B片段［2］。(2)明胶酶(gelatinase):包括明胶酶A(MMP2)和明胶酶B(MMP9)，清除Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅸ型胶原，水解不溶性弹性蛋白，进一步降解裂解的胶原片段。(3)基质胶原酶(stomelysins):包括基质溶解素1(MMP3)、基质溶解素2(MMP10)和基质溶解素3(MMP11);激活其它MMPs酶原，降解蛋白多糖、层黏连蛋白、纤维黏连蛋白和Ⅳ型胶原的非螺旋集团。(4)膜型金属蛋白酶(membrane type MMPs, MTMMPs)： 包括MT1MMP (MMP14)、MT2MMP(MMP15) 、MT3MMP (MMP16) 以及近来分离命名的MT5MMP，是最近克隆出的MMPs家族新成员。(5)其它类：包括MMP4 、MMP5 、MMP6 、MMP19和MMP20 等。

所有的MMPs 都有以下生理特性［3］: (1) 均以潜酶方式分泌; (2) 均含有两个锌离子，其中一个位于催化活性中心,为酶活性所必需的辅助因子; (3)均含有两个钙离子，参与酶的激活;(4) 均为内肽酶;(5) 其活性可以被特异性TIMPs所抑制。MMPs 主要功能为降解除多糖以外的全部细胞外基质成分，它可在多种酶作用下相继激活，形成瀑布效应，具有重要的生理和病理意义。

MMPs与其组织抑制剂相互作用所构成的动态平衡共同维持着心血管基质的分解和重塑。血管平滑肌细胞合成和分泌细胞外基质组成血管壁的“骨架”, 主要包括基底膜和间质，正常基底膜是均一、连续的细胞外结构，由Ⅳ型胶原形成三维网状骨架，上面连接着层黏连蛋白、纤维黏连蛋白等，细胞外基质包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白。胶原的更新是一动态的过程，其合成或降解异常能改变胶原网的结构和功能［4］。细胞外基质降解酶系至少有6类：脯肽酶、丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶等）、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和MMPs，其中MMPs是调节细胞外基质动态平衡的最主要酶系。

2MMPs在I/R中的作用

2.1MMP1作用心肌细胞缺氧再复氧实验中MMP1活性和蛋白质以及mRNA表达增加。Chen等［5］研究表明，缺血1 h再灌注1 h心肌MMP1蛋白质和mRNA明显升高。rTGFβ1（recombinant tumor growth factor, rTGF）和特异性MMP抑制剂PD166793可减轻由MMP1引起的心肌损伤和细胞死亡［6］。Li等［7］证实，鼠I/R时MMP1升高并可致心肌损伤，而且凝集素样氧化低密度脂蛋白1能减少MMP1表达和降低心肌梗死（myocardial infarction, MI）面积。Fielitz等［8］实验发现在猪缺血6 h再灌注3 h模型中，非缺血区心肌MMP1表达，在I/R心肌MMP1活性增高；最新实验结果表明，急性心肌梗死后再灌注患者血清MMP1水平显著升高［9］。而且其增加可导致射血分数减少和心指数降低，肌酸激酶、肺毛压和白介素6峰值升高，用镁剂后患者急性心肌梗死再灌注损伤明显改善。另有实验发现，I/R时MMP1免疫反应增高，对明胶溶解和胶原分解活性增加［10］，说明MMP1确实参与了I/R发病过程，且其抑制剂可减轻I/R损伤，但相关机制研究较少。

2.2MMP2MMP2（前体Mr为72；活性形式Mr为62）存在于心内膜、内膜下层、间质组织和心肌细胞内［11］，可降解基底膜主要成分Ⅳ型胶原。MMPs参与细胞外基质重构需要几天至几周时间，而MMP2可在数秒至数小时参与急性病理过程，如血小板聚集、维持血管张力、炎症调节和I/R［12］等过程。

体外内皮细胞缺氧/再复氧实验表明短期缺氧，内皮细胞MMP2、MMP14 mRNA表达减少，伴随MMP2蛋白质分泌减少，但其作用机制不清，随着缺氧时间延长，MMP2基因表达增加，导致酶原分泌增多，但活性形式酶并不增加［11］。Romanic等［12］证实在非MI区MMP2，13增加，而且氟伐他汀能减少这种改变。实验显示在有氧灌注鼠心脏，MMP2酶原和活性形式迅速释放入冠脉血流，分别于I/R后第1分钟和第15分钟达高峰，但MMP9酶原及活性未检测到；随着缺血时间延长，MMP2释放增加；且其释放与心脏机械功能受损有关，但I/R后心肌组织中MMP2酶原和活性形式减少，表明MMP2激活并释放入灌注液是I/R损伤的结果。应用半纯化的MMP2后，I/R心脏功能恢复缓慢，MMP2抑制剂强力霉素可改善心脏机械功能，应用MMP2中和抗体对心功能有保护作用［13］。提示MMP2激活与释放是急性心肌机械功能障碍的效应物。新近研究表明，行冠状动脉搭桥术的稳定心绞痛患者再灌注时，心肌组织切片中MMP2增加，再灌注后1 min MMP2活性形式增加［14］。本室研究发现，鼠在体心脏I/R时，心肌细胞内MMP2蛋白质和mRNA表达增加，PPARγ受体激动剂吡格列酮可降低I/R引起的MMP2表达改变。

但与此相矛盾的结果是：Fielitz等［8］实验证实，在猪缺血6 h再灌注3 h模型中，非缺血区心肌MMP2表达，而在I/R心肌MMP2活性却不增高。但另有研究发现，猪心脏缺血90 min再灌注90 min，MMP2无明显变化，而MMP9则明显高于对照组。出现此种结果的原因可能与观察时间不同有关，也可能由于MMP2确实是参与I/R急性过程，在晚期再灌注时表达减少，但其具体时程目前尚无相关研究。I/R后心脏功能障碍可由应用非特异性MMP抑制剂和灌注MMP2中和抗体而减轻。

对于MMP－2在I/R的作用研究，目前认为除了细胞外基质作用外，I/R时MMP－2在心肌细胞内表达，心脏组织匀浆抗肌钙蛋白I（troponin I，TnI）免疫沉淀也可检测到活性MMP2；共聚焦显微镜示MMP2与TnI共存，免疫金电子显微镜MMP2定位于肌小节，而且I/R后MMP2蛋白水平升高，并对收缩蛋白调节成分TnI有降解作用［15］，TnI的降解可直接导致细胞凋亡［12］，细胞凋亡又是I/R死亡的主要形式之一；另有证据表明转基因鼠TnI降解片段的过表达和心脏TnI基因缺失均可引起心脏机械功能障碍。MMP抑制剂能阻止TnI降解，因此可减轻I/R损伤；扩张性心肌病患者，MMP2同肌小节关系密切，能够消化肌球蛋白重链；这说明收缩蛋白在心肌损伤可能受到MMP2的作用。这是引起心脏收缩功能减低新的分子机制。实验表明缺血预适应可抑制I/R诱导的MMP2释放，其可能原因之一是缺血预适应减少过氧化亚硝酸盐而减少MMP2的激活与释放，从而减少再灌注时其对心脏收缩结构的负性效应。心肌细胞内MMP2沿Z线分布［15］，也有实验发现Z线内，MMP2与辅肌动蛋白共存，且在同样条件下，降解辅肌动蛋白，I/R时MMP2可能还有其它作用靶点，药物抑制MMP活性有可能为预防和治疗心肌I/R提供新的措施。

2.3MMP9在心脏I/R中的作用MMP9最初是由Sopata和Dancewicz于1974年从人的中性粒细胞中提纯获得的一种蛋白酶，Mr为92 000。人的MMP9基因长7.7 kb，含13个外显子，其长度不一，从280 bp到104 kb，内含子从180 bp到96 kb。人的MMP9基因5′端(含公认的转录前启动子)的序列分析，是由Huhtala 等在1991年首次描述的。它包括4个主要元件: TATA盒子，和其他MMP一样位于适当的转录启动位点，TRE(TPA反应元件) ，Tts样反应元件，核因子κB(NFκB)和SP1。NFκB和SP1是佛波酯( phorbol myristate acetate , PMA) 和TNFα有效活化转录启动子的必要条件。在其他的胶原酶和基质溶解素启动子上无NFκB 和SP1作用序列，提示NFκB和SP1在MMP9上调中的独特作用。人类MMP9启动子还含有第二个SP1样元件，位于TRE反应元件的近端。这一元件对TNFα和PMA无作用，但对于由vSRC和炎症刺激所引起的启动子活化过程中是必要的。MMP9存在于心内膜、内膜下层、间质组织和心肌细胞内［16］，其作用底物为血管基底膜的主要成分：胶原Ⅳ、胶原Ⅴ、弹性蛋白、明胶等。在病理状态下，MMP9基因表达产物的量或活性变化可引起继发性基膜损害，但大多数细胞胞体内并不存贮MMP9，在受到特定刺激后由细胞临时合成与释放。

在许多实验性心肌损伤中，MMP9表达或活性增加，如在鼠、兔持续冠脉闭塞模型和猪再灌注损伤模型［12］，新近对鼠慢性研究显示MMP9缺失可减轻持续性冠状动脉结扎诱导左室扩张和胶原聚集，表明MMP9可能在缺血损伤的慢性重构中起主要作用［17］。资料显示MMP9目标基因缺失在I/R诱导心肌梗死保护中发挥重要作用［18］。实验发现，在I/R明胶溶解和胶原分解活性增加，且明胶溶解活性增加是由于MMP9数量的增加，在I/R心肌，MMP9免疫反应增高［10］。新近研究表明，行冠状动脉搭桥术的稳定性心绞痛患者再灌注时，心肌组织切片中MMP9前体增加，再灌注后1 min血浆MMP9前体增加，这是首次发现人心肌和血浆MMP活性同心功能的关系［14］。研究结果显示MMP9可能参与心肌缺血过程，而再灌注损伤时其变化不明显。但另有研究发现，猪心脏缺血90 min再灌注90 min，MMP9则明显高于对照组。出现此种结果的原因可能与观察时间不同有关。

在I/R心肌，中性粒细胞是MMP9的主要来源，同时，它又有助于中性粒细胞迁移、组织破坏、再灌注时激活炎症介质［19］。

2.4TIMP的变化TIMPs 存在于多种组织中，是一种内源性低分子量蛋白质，为一多功能因子家族，目前研究发现它由4个成员组成，依其被发现的先后顺序分别命名为TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。其中TIMP1、TIMP2、TIMP4为可溶性分泌蛋白，TIMP3 为不溶性蛋白。TIMP1 Mr为29 000，其转录本长度为0.9 kb，TIMP2 Mr为21 000，其转录本长度为1.0～3.5 kb，TIMP3 Mr为21 000，其转录本长度为1.2～1.4 kb，TIMP4 Mr为22 600，其转录本长度为1.2～1.4 kb。4 类TIMPs 之间具有高度同源性，其结构共同特点为具有12个高度保守的半胱氨酸残基，形成6个二硫键，把TIMP分子分成两个结构域:一个大环，即N端区域，与MMPs的锌离子活性中心结合，具有抑制MMPs 活性的功能，一个小环，即C端区域，可能与明胶酶原的蛋白定位或复合物的形成有重要意义。保守性最强的区域是N端的前22个氨基酸，其包含相互作用的活化位点，这个位点中的第7个组氨酸和第9个甘氨酸在与锌离子的相互作用中尤显重要。

心肌中MMPs是催化细胞外基质降解的主要酶类，TIMPs功能多样，主要通过两个功能域特异性抑制MMPs的活性。每一种TIMPs都对所有的MMPs具有抑制作用，两者以1∶1 的比例形成非共价性MMPTIMP复合体,这种结合是稳定且不可逆的,从而阻断MMPs与底物的结合。但各有其特殊性，TIMP1、TIMP2 主要抑制MMP1、MMP3、MMP9 的活性。TIMP2还对MMP2的活性具有抑制作用，抑制机制不明。TIMP4 可抑制MMP1，MMP3，MMP7，MMP9的活性，在心脏组织中高水平表达，具有心脏特异性［20］。TIMPs 对细胞增殖的影响随其种类不同所起的作用不同。TIMP1 可能是通过细胞表面的TIMP1 受体起作用，具有抗凋亡促生长的作用，TIMP1 具有红细胞系增长活性，可以促进红细胞的生长，还可以促进成纤维母细胞、上皮细胞、平滑肌细胞(SMC) 及淋巴细胞等的生长。TIMP1 在新生血管的中层中明显升高，为正常的4.4倍,在新生内膜中为正常的1.4倍［21］。TIMP2既可以直接促进也可以抑制细胞生长，可能与所研究的细胞类型不同有关。TIMP3 促进细胞凋亡，TIMP4 可诱导细胞凋亡、促进细胞表型的改变［20］。

在正常心肌，TIMP表达同肌小节关系密切，心肌缺血20 min和再灌注第1分钟即有TIMP4从心脏快速释放入冠脉血流，但TIMP1，2，3不改变，而且依赖于缺血持续时间，使明胶溶解在再灌注期间增加，说明TIMP4在正常心肌稳定中发挥重要作用，其从心脏释放促进心肌I/R损伤［22］。体外内皮细胞缺氧/再复氧实验表明，短期缺氧，内皮细胞TIMP2mRNA表达减少，伴有MMP2蛋白质分泌减少，但其机制不清［23］。新近研究表明，行冠脉搭桥术的稳定性心绞痛患者再灌注时，心肌组织切片中TIMP1增加，随缺血时间延长表达减少，能改善心脏功能［20］。

3展望

MMPs 的活性调节是一个复杂的过程，目前对其了解尚不十分清楚。随着对MMPs了解的深入,人们也在研究怎样抑制MMPs活性以减轻I/R损伤发生。理论上抑制MMPs活性可通过以下途径：(1)加入外源性TIMPs; (2)减少局部MMPs 产生；(3)促进局部TIMP合成；(4) 研制人工合成的MMPs抑制剂。外源性TIMPs受各种因素影响容易发生变性和降解;细胞因子可诱导TIMP合成，但副作用较大时使用受到限制。合成的MMPs抑制剂在动物实验中效果不明显。随着分子生物学技术的进步，利用分子生物学技术使局部TIMP过表达来中和MMPs为治疗I/R损伤带来希望。在治疗动脉粥样硬化中过度抑制或激活MMPs活性均对动脉粥样硬化斑块不利，怎样适度调节MMPs活性改善细胞外基质重构为人们防治动脉粥样硬化提供了一个新的课题。