河川沙塘鳢线粒体细胞色素b(Cyt,b)基因序列分析

摘要采用特异性引物PCR扩增获得了河川沙塘鳢细胞色素b基因序列,并与塘鳢科其余22种细胞色素b基因序列进行比对,运用Mega 3.1软件通过NJ法构建了塘鳢科鱼类系统发育树。结果显示:2尾试验鱼构成1支;Eleotris、Hypseleotri 2个属构成1支;Odontobutis、Perccottus glehni 2个属构成1支;Bostrychus、Butis、Oxyeleotris、Ophiocara 4个属构成1支;Ptereleotris heteroptera单独构成1支。该研究结果可为深入探讨沙塘鳢属及塘鳢科鱼类的系统分类与重新整理提供依据。

关键词河川沙塘鳢;线粒体细胞色素b基因;系统发育

中图分类号 Q959.48 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)19-0288-03

SequencesAnalysisofMitochondrialCytochromeBGeneFragmentofOdontobutispotamophila

XIE NanFENG Xiao-yuGUO Shui-rongLIU Xin-yiYAO Gui-guiWANG Yu-xi

(Fishery Research Institute,Hangzhou Academy of Agricultural Sciences in Zhejiang Province,Hangzhou Zhejiang 310024)

AbstractThe DNA sequences of 1 107 bp mitochondrial cytochrome b gene fragment of Odontobutis potamophila were analyzed with Mega 3.1. The molecular phylogenetic tree was based on the sequences of 22 Eleotridae species with neighbor-joiningmethod(NJ)respectively. The results showed that the phylogenetic relationship between the two samples was closer than else;Eleotris and Hypseleotri,Odontobutis and Perccottus glehni,Bostrychus and Butis and Oxyeleotris and Ophiocara,Ophiocara,each formed a monophyletic branch.These results may be helpful for further understanding systematic classfication and rearrangment of the Odontobutis and Eleotridae fishes.

Key wordsOdontobutis potamophila;cytochrome b gene;phylogeny

河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)隶属鲈形目(Perci-formes)、鰕虎鱼亚目(Gobioidei)、塘鳢科(Eleotr-idae)、沙塘鳢属(Odontobutis),主要分布于长江中、下游及沿江各支流,钱塘江水系,闽江水系,偶见于黄河水系[1]。其肉质细嫩、营养丰富、肌间刺少,是一种较为名贵的小型经济鱼类。

目前,我国记载沙塘鳢属鱼类共计4种,为中华沙塘鳢(O. sinensis)、河川沙塘鳢(O. potamophila)、海丰沙塘鳢(O. haifengensis)和鸭绿沙塘鳢(O. yaluensis)[2]。关于沙塘鳢属鱼类人工繁、养殖方面的研究相对较多[3-6],在一些地区也进行了规模化人工繁养殖的实践生产。但关于沙塘鳢属鱼类系统发育方面的基础研究报道还相对较少。本文对河川沙塘鳢Cyt b序列进行了测定,并与塘鳢科其余种类进行比对分析,以期为沙塘鳢属及塘鳢科鱼类的分类及系统发育研究提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用河川沙塘鳢采集于浙江淳安千岛湖,为千岛湖野生个体,取鱼鳍完整、鱼体健康活泼的2尾作为试验对象。剪取鱼鳍,在95%乙醇中保存备用。

1.2基因组DNA提取、PCR扩增及测序

取0.1 g乙醇保存鱼鳍样品,用蒸馏水、STE(0.1 moL/L NaCl、10 mmoL/L Tris-Cl、1 mmoL/L EDTA,pH值8.0)缓冲液浸泡洗涤直至将骨肉组织中的乙醇去除。加入900 μL STE、90 μL 10%SDS,10 μL 20mg/mL蛋白酶K,56 ℃下至消化完全,加苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提,2倍体积无水乙醇沉淀,40 μL TE溶解,电泳检测,4 ℃保存备用。

PCR扩增引物为L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCG TTG-3′);H15915(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC3′)[7]。PCR反应体系总体积为50 μL,其中10×缓冲液5 μL,dNTPs 2 μL(各2.5 mmoL/L),上、下游引物各1 μL(20 μmoL/L),Taq酶2 U。PCR反应条件为94 ℃预变性4 min,然后94 ℃变性45 s,54 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,35个循环,最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用上海生工DNA凝胶回收试剂盒回收纯化,并送至上海生工生物工程公司进行双向测序,测序仪为ABI3730。

1.3序列分析

将所测序列结合Genbank中得到的塘鳢科其余鱼类Cyt b序列(表1)运用Clustal W程序将测得序列进行比对,辅以手工校正,得到比对序列。然后使用mega 3.1软件对比对序列进行分析。并用邻接(Neighbor-Joining,NJ)法构建系统树,系统树各分支的置信度由1 000次自举法(Bootstrap)检验。相对遗传距离用Mega 3.1中的“Pairwise distance”计算。

2结果与分析

2.1序列特征分析

试验鱼Cyt b基因片段经PCR扩增、回收、纯化、测序,与Genbank中查得的塘鳢科其余22种鱼类Cyt b序列(表1)进行比对,辅以手工校正得到1 107 bp的比对序列。河川沙塘鳢Cyt b基因序列如图1所示,T、C、A、G平均碱基组成频率分别为31.3%、27.4%、28.9%、12.5%,A+T含量大于C+G含量(图2)。

24条Cyt b基因序列通过比对得到保守位点538个,变异位点569个,其中简约信息位点504个,平均转换/颠换为1.31。

2.2分子系统树的构建

用分子系统学软件Mega 3.1中的NJ法获得唯一的1个系统树,其拓扑结构显示于图3。Bootstrap1000给出了各支的置信度,最高值为100。24条序列隶属于9个属,Eleotris、Hypseleotri 2个属构成1支,Odontobutis、Perccottus 2个属构成1支,Bostrychus、Butis、Oxyeleotris、Ophiocara 4个属构成1支,Ptereleotris heteroptera单独构成1支。各种间相对遗传距离如表2所示。

3结论与讨论

目前记载的塘鳢科(Eleotridae)鱼类包括Butinae、Eleo-trinae 2个亚科,23个属[8],其中在我国存在分布的有16个属[9]。本文中涉及的种类包括9个属,其中Bostrychus、Butis、Ophiocara及Oxyeleotris隶属Butinae,在构建的分子系统树中显示其构成1个分支,支持其为同一亚科;而其余5个属在分子系统树中分为3支,Eleotris与Hypseleotris构成1支,Odontobutis与Perccottus构成一支,Ptereleotris单独构成1支,未能在亚科水平上聚类。任岗等[10]用12S rRNA基因片段构建的系统树显示Oxyeleotris、Ophiocara与Butis聚类为1支,与本文的研究结果存在一定差异,说明选择不同的基因在系统发育研究中存在差异。对于更加准确的物种间研究系统发育需要综合多方面的研究进行综合分析。又由于本文研究未能包括塘鳢科中全部分属,对于塘鳢科分为2个亚科的结论有待进一步的探讨。

本文中2尾试验鱼样本相对遗传距离为0.010,而Eleotris pisonis与Eleotris picta、Eleotris acanthopoma与Eleo-tris sandwicensis相对遗传距离分别为0.008、0.017,与2尾试验鱼间相对遗传距离相当。Eleotris pisonis与Eleotris picta、Eleotris acanthopoma与Eleotris sandwicensis属于种间关系或还是亚种关系,需要更多的证据进一步地判定。

动物的系统发育是动物地理学,尤其是系统发育动物地理学研究的主要方法,通过分析动物的系统发育,进而探讨物种生物地理格局的演化、种群基因谱系格局等情况。塘鳢科鱼类种类较多,分布较广,尤其是在东亚及东南亚地区的分布广泛,且海淡水均有分布,是研究动物地理学比较理想的材料。塘鳢科鱼类系统发育的研究,对探讨塘鳢科鱼类的物种离散、鱼类区系发展及地理演变具有一定的指导意义。

4参考文献

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[3] 黄鲜明,朱卫斌,叶新根,等.沙塘鳢池塘养殖技术的初步研究[J].水利渔业,2008,28(1):57-58,90.

[4] 王吉桥,史建国,姜玉声,等.鸭绿沙塘鳢繁殖习性的观察及性腺发育周期的组织学研究[J].水产科学,2008,27(8):379-385.

[5] 胡先成,周忠良,赵云龙,等.河川沙塘鳢孵化腺的发生及孵化酶的分泌[J].动物学报,2007,53(3):511-518.

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[8] TAXONOMY BROWSER[DB/OL].(2010-01-29)..cn/qkpdf/xdny/xdny201019/xdny201019192-1.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文 相关热词搜索： 线粒体 河川 色素 序列 基因