基因I型草鱼呼肠孤病毒VP7蛋白合成肽抗体的制备及应用

摘要：【目的】制备基因I型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）VP7蛋白合成肽抗体并验证其特异性，为研究VP7外衣壳蛋白在基因I型GCRV病毒与宿主间的相互作用及研制基因工程疫苗提供参考依据。【方法】以GCRV GZ1208株为模板进行RT-PCR扩增，运用在线生物信息学分析软件对VP7蛋白B细胞表位进行功能预测，选择位于VP7蛋白第26～39位氨基酸的多肽序列进行人工合成，与钥孔血蓝蛋白载体蛋白偶联后免疫新西兰白兔以获得VP7蛋白合成肽抗体，然后采用Western blotting和间接免疫荧光试验验证VP7蛋白合成肽抗体对基因I型GCRV的特异性识别能力。【结果】VP7蛋白氨基酸序列在基因I型GCRV中高度保守，其合成肽抗体效价约1∶256000。Western blotting分析结果显示，融合蛋白VP7约在55 kD处出现单一的特异性条带，而GZ1208株和JX0901株样品约在30 kD处出现对应的特异性条带，与预期结果基本一致；间接免疫荧光试验结果表明，VP7蛋白合成肽抗体可特异性识别感染基因I型GCRV的草鱼脑细胞（GCB），感染细胞中出现特异性绿色荧光信号，而感染其他基因型GCRV及正常未感染病毒的GCB细胞中均无特异性绿色荧光出现。【结论】制备获得的VP7蛋白合成肽抗体能特异性识别基因I型GCRV，而不识别其他基因型毒株，可用于草鱼出血病的临床诊断和基因I型GCRV的病原学研究。

关键词： 草鱼呼肠孤病毒（GCRV）；基因I型；VP7蛋白；原核表达；合成肽抗体

中图分类号： S943.112 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）09-1849-09

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【研究意义】草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国最重要的淡水经济鱼，其产量约占全国淡水鱼生产总量的20%（Rao and Su，2015），除西藏和青海呈零星养殖外，在我国其他各地均有一定规模养殖。据全国渔业统计结果显示，2014年我国草鱼养殖产量达506.99万t，2015年576.62万t，2016年589.88万t，其产值多年以来均稳居我国淡水鱼养殖首位。草鱼在全球40多个国家和地区均有分布（Dong et al.，2012），但随之而来的病害日趋频发，尤其是出血病严重阻碍了草鱼养殖业的健康发展（Brudeseth et al.，2013）。草鱼出血病主要由草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）引起，是我国分离鉴定的第一例水生病毒（Zhang et al.，2008），且该病毒致病力强、传染性高（Lu et al.，2011），一旦感染可导致草鱼苗大量死亡，造成严重的经济损失。因此，加强GCRV的致病机理及其防治措施研究，对确保草鱼养殖业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】GCRV是研究水生呼肠孤病毒复制和发病机理的代表病毒（He et al.，2011），其基因组由11个双链RNA节段（S1～S11）组成，无囊膜，呈20面体的球状颗粒（Ye et al.，2012）。目前，已报道GCRV拥有40多个分离株，包括854、861、873、875、876、90l4 、991、V、 H-962、ZV-8802、854、HZ08、JX09-01、JX09-02、GD108、104、106、109、Hunan1307和GZ1208等分离株，且不同分离株在致细胞病变、毒力、基因组电泳带型、基因组序列和特征等方面存在明显差异（Wang et al.，2012；Ye et al.，2012；Fan et al.，2013）。根据基因组差异，GCRV可分为3种基因型（Wang et al.，2012），其中873、HZ08、104分离株分别为基因I、II和III型的代表株（曾伟伟等，2017）。不同基因型GCRV感染草鱼后引起的症状不完全相同，对草鱼的致病率和致死率也不相同（张敏利等，2018）。其中，基因I型GCRV的S10节段编码蛋白与银大马哈鱼呼肠孤病毒（Coho salmon reovirus，SCSV）和条纹鲈呼肠孤病毒（Striped bass reovirus，SBRV）S10节段编码的外衣壳蛋白，以及哺乳动物正呼肠孤病毒（Mammalian orthoreovirus，MRV）S4节段编码的外衣壳蛋白同源性较高，具有相同的锌指结构和相似的亲水基团分布情况，由此预测GCRV的S10节段基因编码一种外衣壳蛋白（Liu et al.，2016）。Chen等（2013）研究证实，GCRV含7种结构蛋白和4种非结构蛋白，其中VP7具有较好的抗原性。郝贵杰等（2010）以VP7基因为靶基因构建重组表达质粒，并成功转染至真核细胞中，实现了高效表达；Luo等（2015）的抗体中和试验结果也证实，VP7是GCRV的主要抗原表位，为研制GCRV基因疫苗提供了参考资料。采用原核表达系统获得重组蛋白再免疫实验动物制备多克隆抗体的方法较常见，但存在抗体特异性差、效价低的问题。合成肽是以化学合成方法按蛋白氨基酸順序合成类似抗原表位的一种保护性短肽，与变性蛋白的结合性较高，抗原的特定区域能被合成肽识别（高华义等，2018）。合成肽属于小分子物质，以半抗原形态存在，很难在免疫动物体内引起有效的免疫反应，因此必须耦联载体蛋白（黄剑波，2016）。Tanzadehpanah等（2016）研究表明，以合成肽为抗原制备多克隆抗体，可降低抗原用量，且得到的多克隆抗体效价较高。【本研究切入点】GCRV GZ1208株分离自广州某养殖场发病草鱼，其S10节段全长909 bp，含一个831 bp的开放阅读框（ORF），编码VP7外衣壳蛋白（分子量约30 kD），但至今未见针对VP7蛋白合成肽制备抗体的研究报道。【拟解决的关键问题】以GCRV GZ1208株为模板进行RT-PCR扩增，运用在线生物信息学分析软件对VP7蛋白B细胞表位进行功能预测，选择位于VP7蛋白第26～39位氨基酸的多肽序列进行人工合成，与钥孔血蓝蛋白载体蛋白偶联后免疫新西兰白兔以获得VP7蛋白合成肽抗体，然后采用Western blotting和间接免疫荧光试验验证合成肽抗体对基因I型GCRV的特异性识别能力，为后续研究VP7外衣壳蛋白在基因I型GCRV病毒与宿主间的相互作用及研制基因工程疫苗提供参考依据。